| 题名 | 毛细管等速电泳动力学研究及其在高灵敏 苯并(a)芘-DNA加合物检测中的应用 |
| 作者 | 刘胜权 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2013-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 汪海林 |
| 关键词 | 苯并（a）芘DNA-加合物 毛细管等速电泳 单分子成像 多元回归分析 基因多态性 B(a)P-DNA adduct Capillary electrophoresis Isotachophoresis single molecule imaging Multiple regression analysis gene polymorphism. |
| 其他题名 | Capillary isotachophoresis dynamics research and its application in highly sensitive detection of B(a)P-DNA adduct |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 环境致癌物在生物体内经代谢活化攻击DNA碱基形成DNA加合物，它不仅是污染物在生物体内经过代谢活化，去毒，DNA修复等多过程的结果，反映了污染物的内暴露剂量；同时DNA加合物可能诱导基因突变，启动癌症的发生进程，是化学致癌的关键步骤，因而也能用于污染物的毒性效应评价、易感人群筛查、癌症的早期诊断和预防。因而，DNA加合物是重要的致癌物暴露与效应的生物标志物，但由于DNA加合物在生物体中的含量很低，约为1个加合物/108-109个核苷酸，因此发展高灵敏的检测分析技术是研究的关键。我们实验室发展了高灵敏的毛细管电泳-激光诱导荧光（CE-LIF）方法，在临床分析和环境健康研究中将有重要的应用价值。 在线聚焦是毛细管电泳分离的典型优势，也是毛细管电泳取得高灵敏检测的关键手段，现已发展出多种技术，如场强放大聚焦，pH调节聚焦，胶束电动毛细管色谱，等速电泳等，实现样品预处理和高灵敏检测分析。目前，人们许多在线聚焦技术的聚焦机理了解的有限，深入研究聚焦的动态过程和机理对发展高灵敏的检测分析方法将具有重要的指导意义。 在本文中，我们以等速电泳为模型，通过毛细管电泳-单分子成像（CE-SMI）观察单个DNA分子运动的变化，深入研究了等速电泳场强分布和调节变化的动力学；在此基础上，以多环芳烃类化合物苯并(a)芘在人体内最终代谢产物邻二醇环氧苯并(a)芘(BPDE) 与DNA 形成的加合物为研究对象，发展了基于瞬时等速电泳的CE-LIF高灵敏检测分析苯并(a)芘-DNA加合物技术；最后将其用于太原地区人群血液样本中苯并(a)芘-DNA加合物的分析，对其毒性效应和健康风险进行了研究。本文共分为五章，简述如下： 第一章 介绍了苯并(a)芘代谢活化形成苯并(a)芘-DNA加合物及其毒性效应，并对目前主要的DNA加合物检测分析方法，32P后标记法，液相-质谱法，免疫法，毛细管电泳-激光诱导荧光法（CE-LIF）等进行了简要介绍。由于毛细管电泳在线聚焦在高灵敏分析中广泛应用，因而对目前主要技术手段进行了介绍，场强放大聚焦，pH调节聚焦，胶束电动毛细管色谱，等速电泳等；并侧重介绍了等速电泳的原理，改进，联用技术和最新进展。 第二章 发展了毛细管电泳-单分子成像（CE-SMI）直接实时观测单个DNA分子运动，研究非均一电场场强动态变化的方法。我们以毛细管等速电泳（cITP）为模型，对检测窗口处单个DNA分子的实时运动成像，得到在cITP中DNA分子的速度-时间曲线。而DNA速度与场强相关，从而得到cITP中场强的动态分布信息及场强调节的动力学。我们发现电渗流（EOF）会改变cITP的场强调节动态过程，这是由于在EOF驱动的cITP中，终止电解质（TE）区带需预先进入毛细管，在受到前导电解质（LE）调节时，为了形成高场强区带，就必须根据欧姆定律降低区带电导率，因而伴随着TE从原有位置的大量质量传递，形成强大的传质阻力，成为cITP场强调节的决速步；因而最终导致原TE区带裂分为高场强和低场强TE两个区带。区带在190 nm紫外吸收变化曲线进一步证实了这一过程。随LE的进入，高场强TE区带的场强显著增强，区带长度也会增加。因而，我们首次提出了EOF驱动cITP的三区带模型，而在EOF抑制的cITP中，场强的动态调节与传统的二区带模型吻合，这表明现有的等速电泳理论需要进一步发展。在EOF驱动cITP中形成的高场强TE区带导致DNA分子反向加速并聚焦在LE/TE界面，因而提供了实现样品大体积聚焦的基础；基于此，我们发展了新颖的DNA单分子聚焦方法，将毛细管中大体积极低浓度下随机分布的、难以检测的DNA分子（μL）压缩至pL级的LE/TE界面处，方便单分子成像分析，实现对极低浓度DNA分子（~ 4×10-17mol/L）的单分子成像检测。 第三章 发现了大气CO2在电泳缓冲液中的溶解引导的苯并(a)芘-DNA加合物瞬时等速电泳（t-ITP）的增强聚焦效应。我们发现电泳缓冲液放置时间增加会增强苯并(a)芘-DNA加合物的t-ITP聚焦效应，干冰溶解实验推测可能是大气CO2溶解导致的；而大气CO2在pH 8.5主要解离形成的HCO3-，其浓度（~ 6.9 mM）与HCO3-实际起聚焦增强效应的浓度（~ mM）一致，进一步证实了这一现象。毛细管电泳-激光诱导荧光（CE-LIF）发现HCO3-可能起前导离子作用，而毛细管电泳-单分子成像（CE-SMI）考察瞬时等速电泳（t-ITP）场强变化的动态过程，发现HCO3-会增强t-ITP中TE高场强区带的场强，因而可能增强t-ITP中LE的场强调节能力。基于此，我们发展了CE-LIF高灵敏检测苯并(a)芘-DNA加合物的分析方法。 第四章 对太原地区人群苯并(a)芘-DNA加合物检测，结合问卷调查和基因多态性进行了多元回归分析。我们利用UPLC-MS/MS鉴定的苯并(a)芘-DNA加合物标准品，建立了CE-LIF高灵敏分析苯并(a)芘-DNA加合物的方法，线性范围为5.90×10-13-2.34×10-11 mol/L，检测灵敏度能够达到5.90×10-13 mol/L。与中国疾病控制研究中心合作，我们分析了太原地区人群全血白细胞DNA中苯并(a)芘-DNA加合物的含量，203个样品中加合物的分布范围为2.13±0.08~31.99±3.62个加合物/108个核苷酸。我们采用多元回归分析考察了问卷调查，苯并(a)芘在尿液中的代谢产物1羟基芘的含量，以及易感基因的基因多态性等参数对苯并(a)芘-DNA加合物的影响。我们发现苯并(a)芘-DNA加合物与1羟基芘和CYP1A1的基因多态性显著相关，而与GSTM1，GSTT1等没有明显的关系，问卷调查中的诸参数对加合物含量没有明显影响。 第五章 对毛细管电泳单分子成像技术研究非均一电场中的动态变化中的应用及毛细管电泳-激光诱导荧光技术检测实际样品中苯并(a)芘-DNA加合物含量及相关统计分析进行了展望。 |
| 公开日期 | 2014-08-22 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/7645]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 刘胜权. 毛细管等速电泳动力学研究及其在高灵敏 苯并(a)芘-DNA加合物检测中的应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2013. |
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