本发明涉及一种2, 5-二氨基-3, 4-噻吩二羧酸乙酯衍生物的制备方法和用途，该类化合物以硫黄和氰基乙酸乙酯为原料，在三乙胺的催化下，与取代苯甲醛或芳杂环醛缩合得到。采用MTT法对所合成的化合物进行了人乳腺癌细胞(T47D、MCF-7)、人宫颈癌细胞(Hela)、人子宫内膜癌细胞(Ishikawa)的抗肿瘤活性筛选，实验结果表明：化合物1，2b，2c，2e，2h-2l对T47D细胞株的抑制活性明显；化合物2a，2b，2c，2h，2j对MCF-7的抑制作用较强；化合物2j对四种癌细胞株均表现出了很强的抑制活性，对于MCF-7、Hela和Ishikawa三种癌细胞株的IC50分别为2.4μM、4.7μM和7.6μM，均好与阳性对照药阿霉素。本发明所采用的制备方法反应条件温和，实验步骤简捷。