| 题名 | 漆酶发酵的超声强化及漆酶的磁性分离 |
| 作者 | 王锋 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2010-06-08 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 刘春朝 |
| 关键词 | 漆酶 变色栓菌 超声 磁性介孔材料 分离 |
| 其他题名 | Ultrasound-intensified Laccase Fermentation and Magnetic Separation of Laccase |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 中文摘要 | 漆酶（苯二醇∶氧氧化还原酶，EC l.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，其在造纸、纺织和食品工业等领域有着广泛的应用前景。然而，由于漆酶存在表达水平低、分离纯化操作复杂的问题，导致其应用成本高而无法实现大规模工业化应用。本论文针对上述存在的问题，开展了超声强化漆酶发酵过程的研究，建立了游离菌丝体和固定化菌丝体漆酶发酵的超声强化策略，探索了磁性介孔氧化硅纳米颗粒合成及其在漆酶分离纯化中的应用，并将磁性介孔氧化硅纳米颗粒直接用于漆酶催化剂的制备。实验进行了超声强化策略的条件优化，确定变色栓菌漆酶发酵的最佳超声强化策略为：在培养周期的48 h和60 h分别超声一次，超声时间5 min。在此条件下，漆酶发酵周期为5天，发酵液漆酶活力和蛋白含量分别为588.9 U/L和0.122 mg/mL，与对照相比分别提高79.1%和67.1%。超声对漆酶从胞内的释放起一定的促进作用，同时超声可提高变色栓菌菌球的孔隙率，有利于发酵过程传质的改善；超声强化策略将96 h时的菌丝体胞内漆酶活力水平提高至对照的4倍以上，促进了漆酶的合成，这也是超声强化策略提高变色栓菌漆酶发酵水平的作用机制之一。为了进一步提高变色栓菌的漆酶发酵水平和生产强度，实验进行了海藻酸凝胶固定化变色栓菌的漆酶发酵，固定化菌丝体的预培养对其漆酶发酵水平影响显著，固定化菌丝体装载量以15%（v/v）为最佳，固定化变色栓菌漆酶发酵能力可达到503.3 U/L。在此基础上，实验确定了固定化变色栓菌漆酶发酵的最佳超声强化策略为：在培养周期的36 h和48 h分别超声一次，超声时间7 min。在此条件下，漆酶发酵周期为72 h，发酵液漆酶活力和蛋白含量分别为1084.7 U/L和0.22 mg/mL，超声强化的固定化变色栓菌的漆酶发酵水平与对照相比提高116%。超声能够改善海藻酸凝胶表面液膜的传质，超声后的膜扩散速率为没有超声的1.56倍。固定化菌丝体重复使用10次后其发酵水平仍保持在1000 U/L以上。实验采用聚醚胺为模板，以正硅酸乙酯为硅源，合成了具有蠕虫状三维介孔孔道的磁性介孔氧化硅纳米颗粒；通过合成温度的调节，可制备的不同孔径的磁性介孔纳米颗粒，在25-80℃的合成温度范围内，其孔径随着合成温度的升高从3.6 nm逐渐增大到27.1nm，相应的孔体积从0.82 cm3/g增加到3.00 cm3/g， BET比表面积则由820 m2/g 降低至501 m2/g；磁性介孔氧化硅纳米颗粒表现出了良好的超顺磁性，合成温度对其没有影响。磁性介孔氧化硅纳米颗粒表面通过硅烷偶联剂连接亚氨基二乙酸并进行Cu2+螯合，形成磁性介孔亲和吸附载体。在漆酶模拟体系中，当磁性介孔亲和吸附载体的孔径由3.6 nm增大到27.1nm时，磁性介孔亲和吸附载体吸附量从88.4 mg/g提高到427.9 mg/g。对变色栓菌发酵液的漆酶分离，磁性介孔亲和吸附载体的孔径为14.5 nm时，漆酶纯化倍数可达到60.6倍，酶活得率高达114.6%，SDS-PAGE结果显示，分离得到的漆酶纯度高于商品漆酶的水平，磁性介孔亲和吸附载体在循环使用10次后仍保持较好的漆酶分离效果。磁性亲和吸附载体从发酵液中吸附的漆酶不经解吸可以直接作为磁性漆酶催化剂使用，酶活回收率达到120.4%；磁性漆酶催化剂的最适反应pH为5.5，最适反应温度为60℃，与游离漆酶比较，磁性漆酶催化剂具有更宽的pH使用范围，其储藏稳定性和热稳定性显著增强。磁性漆酶催化剂能够进行多种酚类物质的降解，其降解最适pH条件受所选酚的种类影响较小，在5.5-6范围内；而最适反应温度受其影响较大， 4-硝基酚、4-甲氧基酚和2,4-二氯酚为45℃，邻苯二酚为60℃；苯酚为25℃；重复利用磁性漆酶催化剂进行邻苯二酚和苯酚降解10次后，磁性漆酶催化剂降解能力保持了其初始降解率的87.1%和82.5%。 |
| 英文摘要 | Laccase (benzenediol: oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2), which belongs to a group of polyphenol oxidases containing copper atoms in the catalytic centre, has been used widely in the paper, textile and food industries. However, the industrial application of lasscase is still limited due to its high production cost resulted from low fementation productivity and complex, costly and time-consuming purification process. Therefore, there is a great interest to develop some novel bioprocessing strategies for intensifying laccase production. Ultrasound was employed to intensify the laccase fermentation process and its operation conditions were optimized for both free and immobilized mycelium system. Magnetic mesoporous silica nanoparticles chelated with Cu2+ were synthesized for affinity-separation of laccase from the fermentation broth, and the functional nanoparticles adsorbed with laccase can be used directly as biocatalyst. The strategy of ultrasonic intensification was optimized for the laccase production by Trametes versicolor. 5 min of the ultrasonic simulation was given in the fermentation process at 48 h and 60 h, respectively. After 5 days, the laccase activity and protein content reached 588.9 U/L and 0.122 mg/mL respecitively, which was increased by 79.1% and 67.1% compared to the control, respectively. Ultrasound improved slightly the release of the intracellular laccase from the pellets of T. versicolor, and intensified significantly mass transfer inside the pellets. By ultrasonic intensification, the intracellular laccase activity at 96 h was more than 4 times higher compared to that of the control. It indicated that the ultrasound stimulated laccase biosynthesis, which was one of mechanism for the improvement of laccase productivity. |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-17 |
| 页码 | 137 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1490]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王锋. 漆酶发酵的超声强化及漆酶的磁性分离[D]. 中国科学院研究生院. 2010. |
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