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题名	糖蛋白分子印迹聚合物的制备及分析研究
作者	孙晓宇
答辩日期	2019-05-27
授予单位	中国科学院大学
授予地点	北京
导师	师彦平
关键词	样品前处理 糖蛋白 分子印迹 硼酸亲和 Sample pretreatment Glycoprotein Molecular imprinting Boronate affinity
学位名称	理学博士
其他题名	无
学位专业	分析化学
英文摘要	糖蛋白是由寡糖链和多肽链经糖苷键连接形成的一种生物大分子，其糖链结构及构型变化与疾病的发生、发展密切相关。目前，已有多种糖蛋白被用作疾病临床诊断的标志物和治疗靶点，如癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）、甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）、糖类抗原125（carbohydrateantigen125，CA125）等。然而，生物样品基质复杂，目标糖蛋白常以痕量存在，增加了其分离分析的难度。近年来，采用分子印迹技术（MolecualrlyImprintedTechnology，MIT）制备的分子印迹聚合物（MolecularlyImprintedPolymers，MIPs），因其具有构效预定性好、特异识别性强等优点，已在色谱分离、分子识别、生物传感和催化领域得到广泛应用。将MIT与固相萃取技术相结合，赋予了固相萃取剂优异的选择性吸附能力，使其在复杂生物样品分离分析领域凸显出巨大的发展潜力。 常规糖蛋白分子印迹聚合物吸附效率较低，针对该问题，本论文以硼酸试剂为功能单体，通过优化MIPs层厚度，成功合成了吸附效率优越的薄膜型磁性分子印迹聚合物。针对糖蛋白分子印迹聚合物识别位点单一的问题，本论文同时以两种糖蛋白为模板分子，制备了含有两种印迹空穴的糖蛋白分子印迹聚合物，实现了复杂体系中两种目标物的同时选择性识别与萃取。为了拓宽上述工作中糖蛋白分子印迹聚合物的pH使用范围，本论文制备了一种弱酸性环境适用型的硼酸亲和磁性分子印迹聚合物，实现了对弱酸性样品中目标糖蛋白的有效分离分析。上述工作中制备的糖蛋白分子印迹聚合物作为样品前处理材料，主要用于复杂基质中的目标糖蛋白的分离，若要实现糖蛋白的进一步检测，需采用紫外-可见分光光度计（ultraviolet-visiblespectrophotometer，UV-Vis）或质谱（massspectrometry，MS）对印迹材料处理后的溶液进行检测，过程繁琐、费时。为此，在上述工作的基础上，本论文又制备了一种碳量子点复合物表面分子印迹聚合物，成功实现了复杂生物样品中目标糖蛋白的快速识别检测。具体工作如下： 1.针对传统分子印迹聚合物吸附效率较低的问题，本论文制备了对辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）具有高选择性吸附能力的薄膜型磁性分子印迹聚合物（Magneticmolecularlyimprintedpolymers，MMIPs）。首先，采用溶剂热法制备分散性良好的Fe3O4纳米粒子（nanoparticles，NPs）作为磁性载体。然后，通过溶胶-凝胶法在其表面包覆SiO2壳层。SiO2壳层的引入，不但提高了磁性载体的分散性，还为Fe3O4NPs的表面功能化奠定了良好的基础。另外，通过精确控制交联剂的聚合时间，在磁性载体表面形成厚度接近HRP直径的MIPs层。采用透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）、傅里叶转换红外光谱（fouriertransforminfrared，FT-IR）仪、X-射线光电子能谱（x-rayphotoelectronspectroscopy，XPS）仪、振动样品磁强计（vibratingsamplemagnetometer，VSM）和动态光散射（dynamiclightscattering，DLS）仪等对MMIPs进行了详细表征。最后，我们将MMIPs应用于加标HRP的胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）中目标糖蛋白的选择性分离，结果表明，本研究通过引入SiO2壳层和控制MIPs层厚度，提高了印迹聚合物对HRP的吸附容量、缩短了HRP的传质路径，成功提高了MMIPs对模板分子的吸附效率。 2.针对常规分子印迹聚合物识别位点单一、难以实现对多种目标糖蛋白同时选择性识别与萃取的问题，本论文成功制备了双目标物识别的磁性分子印迹聚合物（MMIPs）。首先，采用溶剂热法直接制得Fe3O4-NH2，以其为磁性载体，4-甲酰基苯硼酸（4-formylphenylboronicacid，FPBA）为功能单体，根据硼酸亲和原理，实现了糖蛋白卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）和HRP在磁性载体表面的同时固定。通过精确控制交联剂的聚合条件，成功合成MMIPs。借助TEM、FT-IR仪、XPS仪、同步热分析仪（thermogravimetricanalyzer，TGA）、VSM及DLS仪等对MMIPs进行了系统表征。最后，我们将合成的MMIPs成功用于选择性识别与分离FBS中的HRP和OVA，并结合聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）对分离结果进行了验证。 3.针对传统硼酸亲和磁性分子印迹聚合物在弱酸性环境下吸附性能不佳的问题，本论文以多孔TiO2（pTiO2）包覆的磁性Fe3O4（Fe3O4@pTiO2）为载体，成功合成弱酸性环境适用型硼酸亲和磁性分子印迹聚合物。首先，采用溶剂热法制备分散性良好的Fe3O4NPs，接着在Fe3O4NPs表面引入pTiO2，以4-乙烯基苯硼酸（4-vinylphenylboronicacid，VPBA）为功能单体，多巴胺为交联剂，制备弱酸性环境适用型硼酸亲和磁性分子印迹聚合物（Fe3O4@pTiO2@MIPs）。pTiO2的引入不仅为HRP提供了更多的有效吸附位点，而且pTiO2作为路易斯酸，Ti（Ⅳ）具有强吸电子能力，可降低硼酸试剂中硼原子电子云密度，进而降低硼酸试剂pKa值。由于硼酸作用条件为环境pH值≥硼酸试剂pKa值，因此硼酸试剂pKa值的降低可有效拓宽Fe3O4@pTiO2@MIPs适用环境的pH范围。通过TEM、扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）、FT-IR仪、XPS仪、TGA、VSM、DLS仪及快速比表面积/孔隙分析仪等对Fe3O4@pTiO2@MIPs进行了系统表征。最后，我们将Fe3O4@pTiO2@MIPs应用于碱性FBS（pH=8.5）和弱酸性尿液（pH=6.5）中HRP的选择性识别与分离，借助基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOFMS）对吸附结果进行分析。结果表明，无论在碱性还是弱酸性生物样品中，Fe3O4@pTiO2@MIPs对HRP均显示出良好的选择性吸附性能。该研究成功将硼酸亲和型分子印迹聚合物的pH范围由7.0-9.0拓宽至6.0-9.0。 4.MIPs在糖蛋白的前处理过程中，一般需将MIPs与溶液分离后，结合UV-Vis或MS对分离后溶液进行检测，实现目标糖蛋白的分析，操作过程繁琐、费时。另外，这一处理过程有可能会导致糖蛋白等生物大分子变性、失活。针对上述问题，本论文制备了荧光响应型的碳量子点复合物表面分子印记聚合物（CQDs@SiO2@MIPs），以实现复杂生物样品中目标糖蛋白的快速识别检测。首先，采用高温裂解法制备硅烷化的碳量子点（carbonquantumdots，CQDs），随后通过正硅酸乙酯（Tetraethylorthosilicate，TEOS）的水解作用，制得荧光性能良好的纳米颗粒（CQDs@SiO2）。以HRP为模板分子，CQDs@SiO2为荧光载体，FPBA为功能单体，通过控制TEOS水解条件，制得CQDs@SiO2@MIPs。采用TEM、FT-IR仪、XPS仪、TGA等实现对CQDs@SiO2@MIPs的系统表征。最后，我们将其成功用于荧光检测加标HRP的FBS，实现了对目标糖蛋白的快速识别检测。
内容类型	学位论文
源URL	[http://ir.licp.cn/handle/362003/26343]
专题	兰州化学物理研究所_中科院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室 中国科学院兰州化学物理研究所
作者单位	1.中国科学院大学 2.中国科学院兰州化学物理研究所;
推荐引用方式 GB/T 7714	孙晓宇. 糖蛋白分子印迹聚合物的制备及分析研究[D]. 北京. 中国科学院大学. 2019.

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