农业生产是粮食供给的基础。过去几十年来，化学氮肥施用持续提高了作物产量，但过量的施用对生态环境产生了许多负面效应。为了减缓农业生产对生态环境的损害，减少化学氮肥用量、提高作物氮素利用效率已成为当前我国农业生产的主要任务和目标之一。目前已经有无机氮肥与秸秆还田、硝化抑制剂、叶际固氮菌联合配施等多种提质增效的氮素施用措施。但是这些氮素施用措施在农业生态系统中的生态环境经济效应还有待于进行全面的评估。土壤微生物对于农业生态系统养分物质循环、作物健康和生产力维持均起着重要的作用，且对环境条件变化响应灵敏。原生生物是一类单细胞的真核生物，在土壤食物网中占据着重要的位置，在微生物种群丰度、土壤养分物质循环等方面都发挥着重要的功能. 然而由于研究方法的限制，以往有关农田土壤微生物的研究大多只针对细菌和真菌开展，对不同农田土壤中原生生物群落组成、多样性、生态功能及其对氮素施用措施响应机制的认识还非常有限。从全微生物组角度（细菌、真菌和原生生物）揭示不同土壤类型中微生物多样性和网络互作关系对不同氮素施用措施的响应及其潜在的生态功能，可为优化农田施肥管理措施、进行农田土壤微生物组调控以提高作物氮素利用效率等提供理论依据。
      因此，本文以在黑土、潮土和红壤上开展的中长期不同氮素施用措施的田间试验土壤为对象，采用高通量测序技术研究了土壤细菌、真菌和原生生物的物种组成。根据物种信息进行了功能注释，同时通过功能基因定量PCR、磷脂脂肪酸分析和功能微生物活性测定等进行补充，获得了土壤微生物组的功能信息。研究了土壤微生物组的结构和功能对不同氮素施用措施的响应。在此基础上，采用了网络分析、结构方程模型、随机森林、典范对应分析等多种数理统计方法，分析了土壤微生物组与土壤环境因子，粮食产量之间的相互关系。论文取得的主要结果如下。
      1．高通量测序技术评估了基于18S rRNA 基因V4 区和V9 区的两对微型真核生物通用引物在土壤原生生物群落研究中的可行性。ANOSIM分析结果表明，V4 区引物（R = 0.699, P = 0.001）比V9 区引物（R = 0.558, P = 0.001）更能反映出土壤原生生物群落在土壤类型和施肥处理之间的分异程度。因此，本研究选取V4 区的引物开展后续土壤原生生物群落的分析。
      2．分析了黑土、潮土和红壤不施氮肥、单施氮肥、氮肥和秸秆配施处理在玉米生长期和成熟期时土壤细菌、真菌和原生生物群落的物种组成和结构。结果表明，土壤原生生物群落比细菌、真菌群落对施肥处理的响应要更加敏感。与对照相比，氮素施用降低了21%土壤原生生物alpha多样性，增加了土壤微生物组互作网络的复杂性（网络聚类系数增加了2.21%）。结构方程模型和网络分析结果表明土壤性质决定着微生物组内部一些生物因素和非生物因素之间的交互作用，进而影响了土壤原生生物群落多样性和微生物组互作网络对氮素施用的响应。氮肥和秸秆配施处理对土壤理化性质、土壤微生物组群落多样性和土壤微生物组网络结构的影响比单施氮肥的处理更大。这些结果表明原生生物对氮素添加的响应比细菌和真菌更敏感，可作为环境条件变化的灵敏指示生物。
      3．为进一步探明氮素施用对土壤原生生物群落多样性的影响及其驱动机制，以在潮土、红壤上开展的田间不施氮肥、常规单施氮肥处理、氮肥和硝化抑制剂配施处理、氮肥和固氮菌叶面接种处理土壤作为研究对象，研究了这些氮素施用措施对土壤微生物组（包括细菌、真菌和原生生物群落）物种组成和结构的影响。结果表明，在潮土中，氮肥和硝化抑制剂配施的处理比单施氮肥的处理增加了土壤中铵态氮的含量，是土壤原生生物群落alpha多样性降低的主要影响因素。在红壤中，单施氮肥的处理、氮肥和叶片喷施固氮菌配施的处理通过提高土壤硝化潜势、降低土壤pH，导致了土壤细菌群落alpha多样性的降低。这些研究比较了不同氮素施用措施对土壤微生物组多样性的影响，并揭示出氮素施用导致微生物多样性降低的关键因素。
      4．探讨了黑土、潮土和红壤中土壤微生物组的功能组成在夏季玉米生长时期对单施氮肥、氮肥和秸秆配施处理两种氮素施用措施的响应。结果表明，在三种土壤类型中，与对照相比，氮肥施用措施使得土壤中吞噬型原生生物的相对丰度降低了31%。土壤类型影响了土壤微生物组中其他微生物功能对氮素施用的响应。例如，在酸性的黑土和红壤中，氮素施用显著降低了土壤中氨氧化细菌、捕食型细菌的相对丰度。结构方程模型揭示了在酸性土壤中，氮素施用导致硝态氮的累积，进而引起的土壤酸化是吞噬型原生生物相对丰度显著降低的主要原因。土壤微生物组中功能微生物对氮素施用的响应，指示着土壤中潜在的生态功能变化。例如，吞噬型原生生物的减少会减缓土壤中生物地球化学循环速率，作为潜在生防菌剂的捕食型细菌的减少可能会降低植物抵御土传病害的能力。这部分研
究揭示了氮素施用措施在功能水平上对土壤微生物组的影响，以及对土壤生态功能的潜在影响。
      5．以在夏季玉米生长期和秋季玉米成熟期土壤含水率显著变化的黑土和潮土作为研究对象，研究探讨了土壤含水量对不施氮肥和单施氮肥处理中土壤原生生物群落及其潜在生态功能的影响。结果表明，土壤原生生物群落组成呈现出显著的季节分异。在秋季，土壤原生生物群落alpha多样性、93.5%对季节变化显著响应的原生生物类群的相对丰度、土壤含水率和有效磷的含量都显著高于夏季。土壤含水率是影响原生生物alpha多样性和有效磷含量变异的首要因素，也是影响原生生物群落组成的显著因素（P < 0.05）。本研究还发现了6 种在土壤中广泛存在的吞噬型原生生物类群的相对丰度与土壤含水率、有效磷的含量呈现出显著的正相关性（R > 0.600, P < 0.01）。因此推测土壤含水率在秋季的显著升高激发了一些吞噬型原生生物的活性，促进了其对土壤中微生物的捕食作用，从而提高了土壤中有机质的矿化，对土壤磷的有效性具有潜在的贡献。
      综上所述，本论文比较了不同氮素施用措施对旱地农田土壤微生物组及其潜在生态功能的影响，拓展了我们对于农业生态系统中土壤微生物组的认识，揭示了旱地农田土壤原生生物群落及其潜在生态功能对氮素添加的响应机制。未来应该发展基于土壤类型的精准农业氮素施用措施，从而激发土壤微生物组的农业生态功能，减少化肥的用量，建立起生态可持续的农业发展模式。