题名 | 三疣梭子蟹SP 基因与中华绒螯蟹VLR 基因免疫功能研究 |
作者 | 刘厚荣
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答辩日期 | 2020-05-17
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文献子类 | 博士
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授予单位 | 中国科学院大学
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授予地点 | 中国科学院海洋研究所
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导师 | 崔朝霞
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关键词 | 三疣梭子蟹,丝氨酸蛋白酶,中华绒螯蟹,可变淋巴受体,免疫功能
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学位名称 | 理学博士
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英文摘要 | 具有clip 结构域的丝氨酸蛋白酶(clip domain serine protein,cSP)在甲壳动
物天然免疫体系中发挥着重要作用,然而该蛋白酶在同一物种中不同cSP 功能的
比较研究较少,更是缺乏对免疫信号调节作用的研究。可变淋巴受体基因
(variable lymphocyte receptors,VLRs)是脊索动物七鳃鳗(Petromyzon marinus)
获得性免疫的分子基础,近年来已有报道VLRs 在无脊椎动物的适应性免疫防御
中发挥独特作用。本研究基于基因克隆、原核系统蛋白表达、RNA 干扰、实时
定量PCR 等分子生物学实验技术对3 个三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
clip 结构域丝氨酸蛋白酶(PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3)进行了免疫功能比较分析,
探讨了PtcSPs 与其他免疫基因间的调控关系,并对中华绒螯蟹(Eriocheir
sinensis)可变淋巴受体(EsVLRA)进行了结构分析及免疫致敏效应的研究,从
先天免疫和免疫致敏两个维度分别研究了PtcSPs 基因在蛋白水平的功能多样性
以及EsVLRA 的免疫记忆性。本文主要研究内容及结果如下:
PtcSPs-C 的序列比对结果显示,PtcSP1、PtcSP3 具有胰蛋白酶所特有的
Asp189、Gly216 和Gly226 位点,而PtcSP2 在底物结合口袋位点序列则更为多
样,进化树分析结果表明,PtcSP2 与胰凝乳蛋白酶聚为一枝。经原核重组蛋白
表达系统,分别重组表达了三疣梭子蟹PtcSPs 的SP 结构域(PtcSPs-C)和clip
结构域(PtcSPs-N)。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性验证实验进一步证明,重组
表达复性的PtcSP1、PtcSP3 具有胰蛋白酶活性,而复性的重组蛋白PtcSP2 具有
胰凝乳蛋白酶活性。PtcSP1、PtcSP3 的clip 结构域(PtcSPs-N)对测试的革兰氏
阴性(铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 和溶藻弧菌Vibrio alginolyticus)和
革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 和藤黄微球菌Micrococcus
luteus)菌具有抑制作用。值得注意的是,PtcSP1、PtcSP3 抗菌特性有所不同,
rPtcSP1-N 对革兰氏阳性菌藤黄微球菌的抗菌活性最高(MIC 值小于0.99 μM),
rPtcSP3-N 则对革兰氏阴性菌溶藻弧菌的生长(MIC 值小于0.58 μM)表现出最
强抗菌活性。然而,并没有观察到重组蛋白针对酵母的明显的抗菌活性,也未检
测到明显的PtcSP1-C 和PtcSP3-C 的抗菌活性。此外,菌结合试验中发现,
rPtcSP1-N 和rPtcSP3-N 均对检测的革兰氏阴性菌( P. aeruginosa 和V.alginolyticus)革兰氏阳性菌(S. aureus 和M. luteus)以及真菌(毕赤酵母菌Pichia
pastoris)表现出菌结合活性。菌清除试验结果表明,PtcSP1 具有溶藻弧菌的菌
清除活性并呈现时间依赖性响应模式,暗示PtcSP1 可能作为调理素参与免疫反
应。
三疣梭子蟹PtcSP1、PtcSP2 基因沉默后,除抗脂多糖因子5(PtALF5)之
外,其他PtALFs 表达均受到抑制,而PtcSP3 沉默后所有检测的PtALFs 表达均
受到抑制,提示PtcSPs 调控PtALFs 合成的多样性;PtcSP1 和PtcSP3 的沉默可
上调补体样相关分子的表达,暗示丝氨酸蛋白酶基因与补体样基因之间的拮抗关
系。此外,PtcSP2 基因沉默后机体酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活性并未受
到影响与PO 激活相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂相关基因表达也未受到明显干扰,
而PtcSP1 和PtcSP3 的低表达则使机体内PO 活性明显降低。
中华绒螯蟹EsVLRA 的ORF 长度为2400 bp,编码一个799 个氨基酸长的
蛋白。包括一个LRR_NT 结构域,十三个LRRs 结构域和一个LRR_CT 结构域,
同时,在其C 末端发现了一个明显的凸出环结构。氨基酸序列的多序列比对分
析表明,EsVLRA 具有与其他物种VLRA 一致保守的氨基酸序列组成;系统发
育分析表明,EsVLRA 被归为VLRA 一类,说明中华绒螯蟹中的VLR 是VLRAs
家族的新成员。在所有检测的血细胞、心脏、肌肉、肝胰腺、腮和性腺组织中都
检测到EsVLRA 的mRNA 表达,其中,在肝胰腺、性腺和鳃中具有高表达水平;
值得注意的是,EsVLRA 在雄性蟹的肝胰腺、性腺、鳃和脑中的表达明显高于雌
性。
重组表达的rEsVLRA 可以与革兰氏阴性菌副溶血性弧菌( Vibrio
parahaemolyticus)和铜绿假单胞菌,革兰氏阳性菌藤黄微球菌和金黄色葡萄球
菌以及毕赤酵母强烈结合,但并没有显示出任何抗菌活性,说明EsVLRA 主要
作为一种病原微生物的受体参与免疫识别。免疫致敏试验中,发现健康蟹经过甲
醛灭活的副溶血弧菌刺激时首先在第3 小时表现出显著升高(P < 0.05);在第
二次注射活菌后,EsVLRA 的表达在注射后的第1 小时便显著上调,并且比第一
次注射时表达量高得多(约为第一次峰值的50 倍,P < 0.01);最高的表达水平
出现在第二次攻击后的第6 小时(约为第一次峰值的240 倍,P < 0.01),这种
显著的高表达水平还一直持续到第48 小时(P < 0.01)。表明EsVLRA 可能对
于病原刺激具有记忆性。
对三疣梭子蟹3 丝氨酸蛋白酶的免疫功能研究表明,它们具有丰富多样的免
疫活性。研究认为PtcSPs 可分别通过抗菌活性,病原微生物识别,调理素介导
的细胞免疫,酚氧化酶原激活反应介导的体液免疫以及调控其他先天免疫基因等
多个方面在甲壳动物先天免疫中执行免疫抵御功能。对中华绒螯蟹免疫致敏相关
基因可变淋巴受体的研究表明,EsVLRA 在结构上与七鳃鳗中的VLRA 具有较
高相似性,在功能上作为模式识别受体参与到甲壳动物的免疫致敏过程中。综上,
本研究丰富了丝氨酸蛋白酶的多样性免疫功能的理论基础,同时为甲壳动物的免
疫致敏现象研究提供了新的研究线索。 |
语种 | 中文
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目次 | 第1 章 绪论 .................................................................................................................. 1
第1 节 无脊椎动物免疫防御机制 ...................................................................... 1
1 前言 ............................................................................................................ 1
2 物理防御 .................................................................................................... 3
3 细胞免疫 .................................................................................................... 4
4 体液免疫 .................................................................................................... 4
第2 节 丝氨酸蛋白酶免疫功能研究 .................................................................. 6
1 丝氨酸蛋白酶的结构 ................................................................................ 7
2 丝氨酸蛋白酶参与的免疫反应 ................................................................ 8
2.1 凝血过程中的丝氨酸蛋白酶 ......................................................... 8
2.2 酚氧化酶原激活系统中的丝氨酸蛋白酶 ..................................... 8
2.3 补体系统中的丝氨酸蛋白酶 ......................................................... 9
3 甲壳动物丝氨酸蛋白酶研究进展 .......................................................... 10
第3 节 无脊椎动物免疫致敏 ............................................................................ 11
1 无脊椎动物免疫记忆的发现 .................................................................. 11
2 免疫致敏的概念 ...................................................................................... 12
2.1 免疫致敏的基本特性 ................................................................... 12
3 免疫致敏机制研究 .................................................................................. 14
3.1 抗菌活性 ....................................................................................... 14
3.2 吞噬活性 ....................................................................................... 14
3.3 模式识别分子 ............................................................................... 14
3.4 协同交互作用与剂量效应 ........................................................... 16
4 甲壳动物中免疫致敏研究现状 .............................................................. 17
第4 节 VLR 的免疫特异性 ............................................................................... 18
1 LRR 基序 .................................................................................................. 18
2 VLR 基因研究进展 .................................................................................. 19
第5 节 蟹类SP 基因与VLR 基因研究目的和意义 ....................................... 20第2 章 实验材料与方法 ............................................................................................ 23
第1 节 三疣梭子蟹3 种PtcSP 基因免疫功能研究 ........................................ 23
1 实验材料 .................................................................................................. 23
1.1 动物和菌株 ................................................................................... 23
1.2 主要试剂 ........................................................................................ 23
1.3 仪器设备 ....................................................................................... 25
2 实验方法 .................................................................................................. 26
2.1 质粒提取 ....................................................................................... 26
2.2 目的片段的扩增 ............................................................................ 26
2.3 序列分析与系统进化树构建 ....................................................... 29
2.4 重组蛋白表达载体的构建 ........................................................... 29
2.5 重组蛋白诱导表达 ....................................................................... 29
2.6 重组蛋白收集、纯化与复性 ....................................................... 30
2.7 复性蛋白浓缩与浓度测定 ........................................................... 30
2.8 重组蛋白的蛋白酶活性分析 ....................................................... 31
2.9 抗菌活性试验 ............................................................................... 31
2.10 菌结合试验 ................................................................................. 31
2.11 溶藻弧菌清除活性的鉴定 ......................................................... 32
2.12 siRNA 合成与PtcSP1-RNAi 实验 ............................................. 32
2.13 dsRNA 合成及PtcSP2-RNAi、PtcSP3-RNAi 实验 .................. 34
2.14 血细胞RNA 提取及cDNA 合成 .............................................. 34
2.15 干扰效率检测 ............................................................................. 36
2.16 基因沉默后相关免疫基因表达 ................................................. 36
2.17 干扰后酚氧化酶(PO)活力测定 ........................................... 37
2.18 统计分析 ..................................................................................... 37
第2 节 中华绒螯蟹VLR 基因克隆、表达及免疫功能研究 .......................... 37
1 实验材料 .................................................................................................. 37
2 实验方法 .................................................................................................. 38
2.1 VLR 的组织分布实验样品制取 ................................................... 38
2.2 EsVLRA 的RNA 分离、cDNA 合成和基因克隆 ...................... 382.3 序列和系统发育分析 ................................................................... 39
2.4 EsVLRA 的实时定量PCR 分析 .................................................. 40
2.5 重组质粒的构建 ........................................................................... 40
2.6 重组EsVLRA 的表达和纯化 ....................................................... 41
2.7 抗菌活性测定 ............................................................................... 41
2.8 菌结合活性的测定 ....................................................................... 42
2.9 “疫苗”接种与二次刺激实验 ........................................................ 42
2.10 统计分析 ..................................................................................... 43
第3 章 实验结果 ........................................................................................................ 44
第1 节 三疣梭子蟹PtcSP1 重组蛋白功能及免疫基因互作分析 .................. 44
1 重组蛋白PtcSP1-C 和PtcSP1-N 表达 .................................................. 44
2 重组蛋白底物结合位点分析及酶活性验证 .......................................... 44
3 rPtcSP1-N 的最小抗菌浓度 .................................................................... 47
4 重组蛋白的菌结合活力 .......................................................................... 47
5 菌清除实验 .............................................................................................. 48
6 最佳干扰时间检测 .................................................................................. 49
7 PtcSP1 干扰后相关免疫基因表达情况 .................................................. 50
8 干扰后的PO 活性 .................................................................................. 51
第2 节 三疣梭子蟹PtcSP2 蛋白酶活性及免疫基因互作分析 ...................... 52
1 PtcSP2 的同源和系统发育分析 .............................................................. 52
2 蛋白酶活性 .............................................................................................. 55
3 PtcSP2 的干扰效率 .................................................................................. 55
4 PtcSP2 干扰对AMPs 和SPIs 表达的影响 ............................................ 56
5 PtcSP2 沉默蟹的总PO 活性 ................................................................... 57
第3 节 三疣梭子蟹PtcSP3 重组蛋白功能及免疫基因互作分析 .................. 58
1 重组蛋白PtcSP3-C 和PtcSP3N 的表达 ................................................ 58
2 重组蛋白底物结合位点分析及酶活性验证 .......................................... 59
3 rPtcSP3-N 最小抗菌浓度 ........................................................................ 61
4 重组蛋白的菌结合活力 .......................................................................... 62
5 菌清除实验 .............................................................................................. 636 PtcSP3 最佳干扰时间检测 ...................................................................... 64
7 SP 干扰后相关免疫基因表达情况 ......................................................... 65
8 干扰后的PO 活性 .................................................................................. 66
第4 节 中华绒螯蟹VLR 基因克隆、表达及免疫功能研究 .......................... 67
1 EsVLRA 的序列分析 ............................................................................... 67
2 多序列比对、系统发育分析和三维结构模型 ...................................... 69
3 EsVLRA 表达模式分析 ........................................................................... 72
4 EsVLRA 的重组表达与纯化 ................................................................... 73
5 抗菌活性和菌结合活性 .......................................................................... 73
6 疫苗接种后蟹的存活率 .......................................................................... 75
7 疫苗接种和活菌二次刺激 ...................................................................... 75
第4 章 讨论 ................................................................................................................ 77
第1 节 三疣梭子蟹3 种PtcSP 基因免疫功能 ................................................ 77
1 PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3 蛋白酶活性多样 ........................................... 77
2 PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3 抗菌活性各不相同 ....................................... 78
3 PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3 均为PRP ....................................................... 80
4 PtcSP1 具有调理活性 .............................................................................. 82
5 PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3 对AMP 合成具有调节作用 ........................ 83
6 PtcSP2 不参与proPO 激活 ...................................................................... 84
7 PtcSP1 与PtcSP3 具有补体样分子的调节作用 .................................... 85
第2 节 中华绒螯蟹VLR 的免疫功能 .............................................................. 86
1 EsVLRA 的序列特征 ............................................................................... 86
2 EsVLRA 广泛的组织分布 ....................................................................... 88
3 EsVLRA 是一种PRP ............................................................................... 89
4 EsVLR 参与免疫致敏 .............................................................................. 90
第5 章 总结与展望 .................................................................................................... 92
第1 节 结论与创新点 ........................................................................................ 92
1 三疣梭子蟹PtcSPs 具有多样的生物学功能 ........................................ 92
2 三疣梭子蟹PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3 参与多种免疫基因的调控 ..... 92
3 三疣梭子蟹PtcSP2 不参与proPO 激活 ................................................ 934 中华绒螯蟹中存在七鳃鳗中的免疫适应性基因VLR ......................... 93
5 中华绒螯蟹EsVLRA 可能是一种PRP ................................................. 93
6 中华绒螯蟹EsVLRA 参与免疫致敏 ..................................................... 93
第2 节 存在问题 ................................................................................................ 93
1 三疣梭子蟹中的VLR 基因 .................................................................... 93
2 中华绒螯蟹EsVLRA 的记忆时效 ......................................................... 94
第3 节 展望 ........................................................................................................ 94
参考文献 ...................................................................................................................... 96
致 谢 .......................................................................................................................... 119
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 ........................................ 121
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内容类型 | 学位论文
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源URL | [http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/164734] |
专题 | 海洋研究所_实验海洋生物学重点实验室
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推荐引用方式 GB/T 7714 |
刘厚荣. 三疣梭子蟹SP 基因与中华绒螯蟹VLR 基因免疫功能研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学. 2020.
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