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题名	迪茨氏菌CN-3的石油烃降解机制及烷烃羟化酶功能研究
作者	陈卫卫
答辩日期	2020-11-30
文献子类	博士
授予单位	中国科学院大学
授予地点	北京
导师	胡晓珂
关键词	石油烃 迪茨氏菌 降解 机制 烷烃羟化酶
英文摘要	近年来，由于自然或人为原因造成的石油污染日益严重，对生态环境和人类健康造成了长期和恶劣的影响。相比物理和化学修复，微生物修复具有经济、环保、高效、可持续等优势，成为当今非常重要的环境修复技术。微生物修复石油污染的关键是寻找优质的菌种资源，特别是降解活性高、环境适应性强、底物范围广的微生物。本研究从渤海蓬莱19-3溢油平台的海洋沉积物中，分离到一株耐盐的石油降解菌株Dietzia sp. CN-3，其具有石油烃降解活性高、底物谱范围广和环境耐受性好的优势。利用基因组测序分析和转录组测序分析，预测了烷烃降解相关的生物学过程和代谢途径，包括最为关键的两个烷烃羟化酶基因（alkB和CYP153）。通过荧光定量PCR、插入失活和异源表达等分子生物学手段鉴定了alkB和CYP153的功能。最后，将具备不同石油烃降解和表面活性剂生产能力的迪茨氏菌CN-3与不动杆菌HC8-3S进行组合，评价其石油降解性能，为石油污染的生物修复提供理论依据和技术支持。主要的研究内容和结论如下： 一、从渤海蓬莱19-3溢油平台的海洋沉积物中，分离到一株耐盐的石油烃降解菌株迪茨氏菌CN-3。该菌株能够高效地降解石油烃（91.6%）、单一的烷烃和芳香烃，包括直链烷烃（C10-C36）、支链烷烃（姥鲛烷和植烷）、环烷烃和芳香烃（菲和芘）。迪茨氏菌CN-3具有良好的环境耐受性（温度4-42℃，pH 5-10和盐度0-160 g/L），特别是在高盐度（85 g/L）条件下，石油烃降解活性（85.6%）几乎不受影响。迪茨氏菌CN-3通过生产表面活性剂或改变细胞表面疏水性，加速对不同石油烃的降解。 二、完成了迪茨氏菌CN-3的基因组测序，为探究不同的生物学过程和代谢途径提供全面的遗传背景。基因组学分析显示，迪茨氏菌CN-3的基因组中包含1个染色体基因组和2个质粒基因组，总长度为3741379 bp，GC含量为70.66%。共编码3496个基因，编码基因长度占基因组总长度的88.83%。基因组中含有50个tRNA，9个rRNA和12个基因岛。基因组中注释出大量与烷烃降解相关的基因，包括1个AlkB类型的烷烃羟化酶基因和1个细胞色素P450家族的CYP153烷烃羟化酶基因，以及烷烃单末端氧化途径中涉及到的多种酶，如乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、脂酰辅酶A合成酶等。另外，基因组中注释出19个芳香族化合物降解相关的基因，如邻苯二酚1,2-双加氧酶基因catA、邻苯二酚2,3-双加氧酶基因catE等。在邻苯二酚途径中鉴定出比较完整的基因，暗示该途径在CN-3菌株降解芳香族化合物的过程中起主要作用。 三、完成了迪茨氏菌CN-3分别在琥珀酸钠和正十六烷培养下的转录组测序，全面地分析基因在不同生物学过程中的表达情况。转录组学分析显示，在正十六烷诱导下，迪茨氏菌CN-3的转录谱发生了明显的变化，共找到546个差异表达基因（筛选标准是错误发生率FDR<0.05和差异表达量|Log2FC|>1），其中168个基因表达显著上调，378个基因表达显著下调。其中，涉及到脂类代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、异生物质生物降解和代谢、转录和翻译等生物学过程中的差异表达基因较多，并发现了31个潜在的新基因。起始烷烃降解的烷烃羟化酶基因alkB、CYP153、铁氧还蛋白基因Fdx和铁氧还蛋白还原酶基因FdR强烈地上调表达（log2FC值5.3065-6.198），与荧光定量PCR验证结果几乎一致。同时，与正十六烷单末端氧化途径相关的基因也都有不同程度的上调表达，暗示CN-3菌株通过单末端氧化途径代谢正十六烷。 四、结合体内和体外实验，证实了烷烃羟化酶基因alkB和CYP153在不同烷烃降解中的功能，与前人报道不同，可能是一种潜在的新机制。通过对alkB和CYP153基因的扩增和同源性分析发现，alkB对应的氨基酸序列中具有4个保守基序Hist-1、Hist-2、Hist-3和HYG-motif，被鉴定为AlkB类型的烷烃羟化酶；CYP153基因属于细胞色素P450的CYP153A家族。利用pK18自杀质粒在迪茨氏菌中成功构建了插入失活突变株ΔalkB和ΔCYP，证明了alkB和CYP153基因在中链烷烃、支链烷烃和长链烷烃降解中均发挥作用，但对不同烷烃的利用存在偏好性。CYP153基因在中链烷烃和支链烷烃降解中具有优势，而alkB基因在长链烷烃利用中更具优势。对于超长链烷烃C28，alkB和CYP153基因具有协同作用。上述结果与不同烷烃诱导下alkB和CYP153基因的转录水平分析相一致。此外，从合成生物学的角度，以Pseudomonas putida F1为底盘细胞，人工引入alkB，初步构建了石油烃降解细胞工厂，使F1菌株获得了中链和长链烷烃（C14、C16、C24和C26）降解能力，扩大了底物谱，有潜力成为一株石油污染生物修复的工程菌。 五、选取具有不同石油降解特性和生物表面活性剂生产能力的Dietzia sp. CN-3和Acinetobacter sp. HC8-3S，构建了优势互补的复合菌，并开展了石油污染生物修复的微宇宙实验。相比于单一菌株，该复合菌能够显著地提高石油降解能力，10天内降解95.8%的石油烃，并能够在广谱的pH（4-10）和盐度（0-120 g/L）范围内高效地降解石油。在石油污染生物修复的微宇宙实验中，添加复合菌的生物强化处理组对石油的降解率达到485.8 mg kg-1 d-1，明显高于前人的报道，展示了该复合菌在石油污染生物修复方面的应用潜力。 综上所述，本论文对迪茨氏菌CN-3的石油烃降解效能和机制，以及烷烃羟化酶的功能进行了深入和详尽的分析，证实了烷烃羟化酶基因alkB和CYP153在不同烷烃降解中的分工与合作的作用机制，可能是一种潜在的新机制。本工作的完成将推进迪茨氏菌降解石油的研究，并为其他石油降解菌的相关研究奠定基础，具有重要的参考意义；同时，本工作的完成将会加快迪茨氏菌的遗传改造和环境应用，为石油污染的生物修复提供菌种资源和技术支持。
语种	中文
内容类型	学位论文
源URL	[http://ir.yic.ac.cn/handle/133337/25308]
专题	烟台海岸带研究所_中科院烟台海岸带研究所知识产出
推荐引用方式 GB/T 7714	陈卫卫. 迪茨氏菌CN-3的石油烃降解机制及烷烃羟化酶功能研究[D]. 北京. 中国科学院大学. 2020.

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