| 题名 | 凝血VIII因子C2结构域的结构生物学研究 |
| 作者 | 刘卓 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2009-05-21 |
| 授予单位 | 中国科学院福建物质结构研究所 |
| 授予地点 | 福建物质结构研究所 |
| 导师 | 黄明东 |
| 关键词 | 凝血VIII因子C2结构域 小分子抑制剂 膜结合位点 X射线晶体学 果蝇S2细胞系 共转染 嘌呤霉素 稳定细胞筛选 蛋白表达 |
| 其他题名 | The structure study of Factor VIII C2 domain |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 中文摘要 | 结构生物学是一门以生物物理学和生物化学为基础来研究生物大分子三维结构及其对应生物功能的交叉学科。作为一门可以解释生命活动中各种大分子相互作用的学科，近年来结构生物学得到越来越广泛的应用。 由于生物大分子的直径一般为数个纳米到数百个纳米，即使用最先进的光学显微镜也无法进行观测，因此结构生物学家发展了各种方法来研究生物大分子的结构。目前用于研究生物大分子三维结构常用的实验手段有X射线晶体学、核磁共振、电子显微学、原子力显微镜以及X射线小角散射等。本论文主要基于X射线晶体学的方法来研究蛋白质的结构及功能的关系。 本文通过对凝血VIII因子C2结构域及其小分子抑制剂晶体结构的研究，探讨了凝血VIII因子C2结构域结构柔顺性、其小分子抑制剂结合位点及作用方式。同时，我们从蛋白质的表达纯化入手，优化了果蝇S2细胞作为表达系统的筛选条件，为大量重组蛋白的制备及其X射线晶体学研究工作做了必要的准备。主要研究内容如下： 1.凝血VIII因子C2结构域与其小分子抑制剂的结构生物学研究 血液凝固常发生在外伤出血或血管内膜受损时，它可以阻止受伤后的出血并帮助机体康复，从而保证了血液的不大量流失和血管的完整性。血液凝固的实质是血浆中的可溶性纤维蛋白原变成不可溶的纤维蛋白的过程，这一过程是在多种凝血因子的参与下共同完成的。凝血VIII因子是在凝血级联反应中个起到关键作用的辅助因子。非正常的凝血导致多种的疾病，如凝血VIII因子的基因突变是遗传性一型血友病产生的原因，而凝血IX因子的基因突变是遗传性二型血友病产生的原因。体内凝血反应被激活后，凝血VIII因子可以与带负电的磷脂双层膜结合，并在钙离子的参与下与凝血IX因子形成复合物以加速其后的级联反应。研究表明，凝血VIII因子的C2结构域是其与磷脂双层膜和VWF因子结合的重要功能区，此结构域中的氨基酸突变或缺失在临床上可以导致一型血友病的发生。近年来，人们发现凝血VIII因子作用的非正常增强又可以导致血栓病的形成。所以，更为详尽地了解凝血VIII因子C2结构域的功能，对于临床上有很大的帮助。在本实验中，我们用X射线晶体学的方法研究C2结构域与磷脂膜的结合关系。我们利用已知可以抑制C2结构域与膜结合的小分子，与我们用毕赤氏酵母高效表达的凝血VIII因子C2结构域的蛋白共晶生长，在同步辐射光源下收集到分辨率高达1.15Å的复合物晶体数据。修正后结果显示小分子抑制剂通过疏水作用结合到C2结构的Trp2313－His2315位点。这一研究结果表明C2结构域的Trp2313－His2315对于FVIII因子与磷脂双层膜的结合有着重要的作用，这同时也加深了我们对于FVIII因子C2结构域生理功能的理解。 2.果蝇Schneider 2（S2）细胞表达系统稳定细胞系的筛选和优化 果蝇Schneider 2（S2）细胞系是一种从黒腹果蝇胚胎细胞分离出的昆虫表达系统。作为真核表达系统，S2细胞具有快速培养并稳定表达外源蛋白的特点。为了建立稳定表达的S2细胞系，可以将含有外源基因的质粒与带有筛选标记的质粒用共转染的方式导入S2细胞内，并在细胞培养液中加入相应的抗菌素以达到筛选稳定转染细胞的目的。目前比较成熟的方法是利用pCoHYGRO和pCoBLAST作为筛选质粒，其对应的抗菌素为潮霉素B（hygromycin-B）和灭瘟素S(blasticidin S)。但这两种方法筛选稳定细胞的耗时都比较长至少要两周以上。为了缩短筛选时间，在本实验中，我们对转染过程中的每一个细节进行优化，并采用了pCoPURO作为助转染质粒，加入其相应抗菌素－嘌呤霉素后，仅用六天就筛选出稳定的S2细胞系。这一关键步骤的改进对于接下来的蛋白质结构学研究有真大的帮助。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-05-09 |
| 页码 | 63 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.fjirsm.ac.cn/handle/350002/7752]  |
| 专题 | 福建物质结构研究所_中科院福建物质结构研究所_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 刘卓. 凝血VIII因子C2结构域的结构生物学研究[D]. 福建物质结构研究所. 中国科学院福建物质结构研究所. 2009. |
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