| 题名 | 苯并[a]芘-DNA 加合物立体异构体荧光探针的合成、表征和应用 |
| 作者 | 王超 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2009-05-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 汪海林 |
| 关键词 | 苯并[a]芘 DNA 加合物 立体异构 毛细管电泳 免疫方法 Benzo[a]pyrene DNA adduct Stereochemistry Capillary electrophoresis Immunoassay |
| 其他题名 | Synthesis, Characterization and Application of DNA Fluorescent Probes Containing a Single Site-Specific Stereoisomer of anti-Benzo[a]pyrene Diol Epoxide-N2-dG |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 苯并[a]芘-DNA 加合物是多环芳烃分子毒理学研究中常用的模型探针，可以 用于发展苯并[a]芘-DNA 加合物的检测方法，研究DNA 复制、转录、重组、修 复等重要分子生物学过程中DNA-蛋白质的相互作用。本论文成功地合成和表征 定点修饰的立体异构苯并[a]芘-DNA 加合物荧光探针，并研究了单克隆抗体和苯 并[a]芘-DNA 加合物的亲和作用以及立体选择性。此外还尝试利用合成的加合物 荧光探针，发展了基因组DNA 中苯并[a]芘-DNA 加合物的竞争免疫分析方法及 人血清中特异性抗体的直接免疫分析方法。本论文的主要内容简略介绍如下： 第一章 综述了定点修饰DNA 加合物（包括苯并[a]芘-DNA 加合物）的合 成、纯化表征和应用，以及DNA 加合物检测技术（包括毛细管电泳激光诱导荧 光分析方法）。 第二章 合成并系统表征了在特定位置上共价结合一个立体异构邻二醇环 氧苯并[a]芘（BPDE）的DNA 荧光探针。首先合成了含一个trans-(+)-或者 trans-(−)-anti-BPDE-N2-鸟嘌呤的16mer 寡核苷酸（BPDE-16mer），并通过HPLC、 UV、MS、酶解反应结合HPLC 分析确认所含加合物的存在及立体构型。然后将 立体异构BPDE-16mer 和其他几条寡核苷酸连接，经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化， 最后得到两种单链和两种双链TMR-BPDE-90mer 探针。这四种探针均包含一个 已知立体构象BPDE 加合物和一个荧光标记。通过研究BPDE-16mer 连接到正常 寡核苷酸上的效率，发现经过anti-BPDE 修饰的16mer 会显著降低双链 BPDE-90mer 的合成效率，并产生缺口型90mer 副产物。利用特异性结合BPDE 加合物的抗体与亲和毛细管电泳分析技术（CE），进一步表征了这四种 BPDE-90mer 荧光探针，证明了单个BPDE 加合物的存在。 第三章 细致研究了BPDE 加合物的单克隆抗体mAb 8E11 与不同 BPDE-DNA 加合物的亲和作用及其立体选择性。首先，通过直接CE 免疫分析测 定mAb 8E11 与两种加合物异构体（trans-(+)- 和trans-(−)- anti-BPDE-90mer）的 亲和力，发现trans-(+) 的结合常数要略大于trans-(−)，分别为6.36±0.54×108 M-1 和4.52±0.52×108 M-1。针对竞争性免疫分析，推导出定量分析亲和作用的竞争方 程。利用推导的方程与竞争性CE 免疫分析，确定四种BPDE-dG 立体异构体和mAb 8E11 的亲和力，结合常数依次为3.57±0.22×108 M-1 (trans-(+)-BPDE-dG)、 1.77±0.06×108 M-1 (cis-(+)-BPDE-dG)、1.07±0.03×108 M-1 (trans-(−)-BPDE-dG)和 1.14±0.06×107 M-1 (cis-(−)-BPDE-dG)。采用类似的方法，利用含已知含量BPDE 加合物的基因组DNA，测定了基因组DNA 中BPDE 加合物和mAb 8E11 的亲和 力。结果表明mAb 8E11 仍可以有效结合基因组中的BPDE 加合物（Kb，3.74×108 M-1），但与短链90mer DNA 相比，亲和力有所降低（下降了39.5%）。 第四章 利用合成的加合物荧光探针，尝试检测了基因组DNA 中的BPDE 加合物和癌症病人血清中的特异性抗体。首先推导了定量分析方程，并应用于竞 争性免疫中BPDE 基因组DNA 加合物的检测。另外在血清BPDE 特异性抗体检 测中，发现加合物荧光探针中所含的荧光染料TMR 和DNA 可与血清中的组分 发生一定程度的非特异性作用。通过比较损伤和未损伤探针与血清形成复合物的 不同，可以初步判断血清中是否含有可与BPDE 作用的亲和成分。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 公开日期 | 2010-06-07 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/346]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王超. 苯并[a]芘-DNA 加合物立体异构体荧光探针的合成、表征和应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2009. |
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