| 题名 | 褐藻胶裂解酶基因克隆、表达及酶学性质研究 |
| 作者 | 晁雅熙 |
| 答辩日期 | 2018-06-01 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 国家海洋局第一海洋研究所 |
| 授予地点 | 青岛 |
| 导师 | 陈颢 |
| 关键词 | 褐藻胶 褐藻胶裂解酶 Vibrio sp.QD-5 分离纯化 酶学性质 降解特性 |
| 英文摘要 | 褐藻胶裂解酶是一种能以β-消去方式催化褐藻胶裂解的酶,已经从多种生物中分离获得。褐藻胶裂解酶在底物特异性、作用方式、酶分子一级结构和酶分子空间结构具有不同的特征,根据这些特征,褐藻胶裂解酶被分到了不同的组。褐藻胶是褐藻中含量最丰富的多糖,约占褐藻干重的40%,这种多糖由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)两种单体组成,单体间通过β-1,4糖苷键相连。可以形成多聚β-D-甘露糖醛酸(ployM)、多聚α-L-古洛糖醛酸(ployG)和交替连接的ployGM。褐藻胶寡糖是褐藻胶经褐藻胶裂解酶或者物理化学方法去多聚化形成的产物,在食品和医药行业具有广泛的应用。褐藻胶裂解酶裂解褐藻胶具有高效和高特异性的特点,因此褐藻胶裂解酶一直是各领域的焦点。本研究对实验室保存的一株能够降解褐藻胶的菌株进行了种属鉴定,其16S rDNA序列分析结果及系统进化树的分析结果表明该菌株属于Vibrio sp.,并命名为Vibrio sp.QD-5。对该菌株进行了全基因组测序,基因簇分析结果表明,在菌株Vibrio sp.QD-5的基因组中存在一簇褐藻胶裂解酶基因。利用设计的引物克隆出了两个基因aly-II和aly-IV。褐藻胶裂解酶基因aly-II全长2169 bp,编码了723个氨基酸。氨基酸序列对比结果显示褐藻胶裂解酶Aly-II属于多糖裂解酶家族17(polysaccharide lyase family,PL17)。褐藻胶裂解酶基因aly-IV全长1560 bp,编码了520个氨基酸。氨基酸序列对比结果显示褐藻胶裂解酶Aly-IV属于多糖裂解酶家族7(polysaccharide lyase family,PL7)。本研究构建了aly-IV的异源表达系统,并对异源表达系统的发酵和诱导条件进行了优化。优化后的发酵培养基含有葡萄糖、酵母粉、(NH_4)_2SO_4、柠檬酸钠、NaCl、KH_2PO_4和MgSO_4·7H_2O,初始pH值为6.0;将150 mL液体发酵培养基装入250 mL三角瓶接中,接种4.5 mL的种子液;OD_(600)达到1.0后加入IPTG,使终浓度为0.4 mM;30~oC下诱导8 h。优化后目的蛋白质的含量提高到原来的近1.58倍。当以乳糖为诱导剂时,OD_(600)达到1.0后加入乳糖,使终浓度为0.5 g/L,25 ~oC下诱导10 h,优化后目的蛋白质的含量提高到原来的近1.83倍本研究对Aly-IV进行了表达和酶学性质表征。Aly-IV在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式被表达,利用Sarkosyl对包涵体进行处理后,经镍亲和层析和凝胶层析对Aly-IV进行了纯化。纯化后的Aly-IV的比活力为1256.78 U/mg。对该酶的酶学性质研究发现,Aly-IV的最适温度和pH分别为35~oC和8.9。温度及pH值对酶活性影响的实验发现,高温条件下对酶活性的影响较明显。pH对酶活性的影响不仅与pH值有关,还与缓冲液的种类有关。K~+、Mg~(2+)和Ca~(2+)对酶的活性有促进作用,Cu~(2+)、Ba~(2+)、Al~(3+)、Ni~(2+)、Zn~(2+)、Pb~(2+)、EDTA~(2-)、Co~(2+)和Cr_2O_4~(2+)对酶的活性有抑制作用。反应体系中,NaCl的浓度在1 mM-20 mM时,对酶的活性有促进作用,浓度高于25 mM对酶的活性有抑制作用。底物特异性研究表明,褐藻胶裂解酶Aly-IV对褐藻酸钠和polyG有降解作用。结合酶解产物以及褐藻裂解过程中黏度的变化可以发现,褐藻胶裂解酶Aly-IV以内切的方式对褐藻酸钠进行降解。 |
| 语种 | 中文 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.fio.com.cn:8080/handle/2SI8HI0U/7445]  |
| 专题 | 研究生部 |
| 作者单位 | 国家海洋局第一海洋研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 晁雅熙. 褐藻胶裂解酶基因克隆、表达及酶学性质研究[D]. 青岛. 国家海洋局第一海洋研究所. 2018. |
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