DNA/RNA修饰参与了许多重要的生物过程，并在表观遗传调控中发挥关键作用。液相色谱-质谱分析是人们准确理解各种DNA/RNA生物化学修饰的生理作用和功能的必不可少的手段。基于液相色谱-质谱的DNA/RNA修饰分析涉及一系列生物化学相关的预处理、分离和检测步骤，相关分析仍具有挑战性。

      在本论文中，我们筛选并鉴定出干扰液相色谱-质谱检测核酸修饰分析的因素，并发展了一套普适性预处理方法。在此基础上，发展出准确、快速、易于重复、高灵敏的DNA/RNA修饰的分析方法。利用发展的方法，我们对小鼠组织以及培养细胞mRNA中5-甲基胞嘧啶进行分析和鉴定，并探讨了其甲基化酶和去甲基化酶。论文分为三部分。

      1. 基于UHPLC-MS/MS的DNA修饰整体水平分析的普适性预处理方法

      我们发现，当溶液含有无机阳离子Na+和K+以及磷酸盐，DNase等酶的活性会显著地被抑制，使DNA酶解不充分，并导致后续UHPLC-MS/MS分析产生偏差。为了消除这些常见离子的影响，我们发展了一种高效且独特的垂直超滤方法，可以有效除去这些无机盐而不会造成DNA的损失，并改善了后续的DNA酶解，从而提高了最后的UHPLC-MS/MS分析灵敏度以及准确性。在此基础上，利用垂直膜超滤装置，将超滤脱盐、酶解和除蛋白三个步骤集成，实现一体化预处理。另外，对于未知干扰因素，采用所发展的预处理方法也同样有效。因此，这些创新性的预处理方法，具有普适性，有助于对各种DNA/RNA修饰进行快速、灵敏和稳定的UHPLC-MS/MS分析。

2. mRNA 5-甲基胞嘧啶(m5C)的分析与鉴定

      已有研究表明tRNA，rRNA和mRNA中均存在m5C。我们设想5-甲基胞嘧啶(m5C)或许是mRNA中一种重要修饰，具有调控mRNA的功能。我们在Hela、293T、HCT116、M-1、M-14和小鼠胚胎干细胞(mESCs)的mRNA中检测到了m5C，可达0.9 - 3.7 个/104 rC；在小鼠大脑、小脑、肺、胸腺、大肠、脾、肾和睾丸组织mRNA中均可检测到m5C，可达0.4 - 1.1 个/104 rC。其中，小脑组织中mRNA m5C水平最高(1.1 个/104 rC)。我们通过体外反应验证了甲基化转移酶NSUN2可以催化甲基转移，使RNA胞嘧啶甲基化，产生m5C。通过敲低和过表达，证明了NSUN2是主要的mRNA中 C5-胞嘧啶甲基化转移酶。

3. Tet蛋白催化的RNA m5C氧化

     鉴于mRNA m5C是一种重要的RNA修饰，且存在甲基化转移酶，我们设想RNA m5C是一种动态修饰，可被特定酶催化氧化。已经知道，Tet蛋白是一种Fe2+和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶，可将DNA中的5-甲基胞嘧啶（5mdC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），5-醛基胞嘧啶（5fdC）和5-羧基胞嘧啶（5cadC）。由于DNA 5mdC和RNA m5C之间的唯一区别是前者含有糖脱氧核糖，而后者含有核糖，但Tet蛋白作用于胞嘧啶碱基，我们推测Tet蛋白也可能催化RNA m5C的氧化。体外反应表明，Tet1和Tet2可以介导体RNA m5C的氧化。但Tet1/Tet2双敲除以及其过表达，均未检测到m5C水平的改变。利用建立的UHPLC-MRM-MS/MS分析方法的高灵敏度，我们可以检测到5.0×10-18 mol的hm5C，但在mESCs和293T mRNA中均未检测到hm5C。Hela、HCT116、M-1、M-14 四个细胞系以及小鼠睾丸、肺、脑、胸腺、大肠、脾、肾和小脑8 个组织，均未检出hm5C。这些结果表明Tet1和Tet2在哺乳动物中可能不是RNA m5C主要的去甲基化酶。

    我们进一步分析了来自野生型和Tet敲除果蝇头部、卵巢和早期胚胎组织中的mRNA，并未检测到任何hm5C，表明Tet同源的DMAD蛋白不是果蝇中m5C mRNA的去甲基化酶。

    总体而言，Tet酶可在体外催化氧化RNA m5C。在活体研究方面，我们未能获得Tet酶作为mRNA m5C去甲基化酶的证据。