题名 | 含铬或锰的新型固氮酶的纯化, 特性和结晶—棕色固氮菌突变种UW3中CrFe蛋白和MnFe蛋白的研究 |
作者 | 赵颖 |
答辩日期 | 2005 |
文献子类 | 博士 |
授予单位 | 中国科学院植物研究所 |
导师 | 黄巨富 |
关键词 | 棕色固氮菌突变种 UW3/Cr 和 UW3/Mn CrFe 蛋白 MnFe 蛋白 蛋白质纯化 特性和结晶 |
其他题名 | Purification, Characterization and crystallization of novel nitrogenase containing Cr or Mn——Study on CrFe protein and MnFe protein in Azotobacter vinelandii mutant UW3 |
学位专业 | 植物学 |
英文摘要 | 以含MnSO4或Na2CrO4的无钼无氨的修改Burk’s培养基, 培养不能合成含钼固氮酶体系的棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii Lipmann) 突变种UW3, 发现在一定浓度范围内, MnSO4或Na2CrO4的加入有助于促进其生长。 菌体生长和C2H2还原活性曲线测定结果表明, 这种促进作用很可能是通过Mn或Cr取代Mo, 参与组装固氮酶中心原子簇, 从而影响固氮活性而实现的。 利用阴离子交换 (DEAE-52和Q-Sepharose FF) 和凝胶过滤 (Sephacryl S-200) 柱层析从两种菌体中纯化得到固氮酶组分Ⅰ蛋白 (分别命名为MnFe蛋白和CrFe蛋白), 并对其进行了特性研究。 厌氧天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 和SDS-PAGE结果显示, 两种蛋白均为两种亚基组成的四聚体。 亚基可以与OP MoFe蛋白抗体发生免疫反应, 分子量分别略小于野生种OP MoFe蛋白的α和β亚基。 CrFe蛋白的C2H2还原活性, Ar下放氢活性和固氮活性分别相当于OP MoFe蛋白的36%, 38%和43%, 而MnFe蛋白活性相当于OP MoFe蛋白的50%左右, 并且两种蛋白与OP MoFe蛋白具有相似的固氮电子利用率。 对两种蛋白金属含量的测定证实其中分别含有Mn和Cr, 但仍存在少量Mo污染。 与OP MoFe蛋白相比,这两种蛋白圆二色谱的摩尔椭圆率 ([θ]) 除在450nm较接近外,在可见光区的其它波长处均显著降低。 与DT还原OP MoFe蛋白相似, CrFe蛋白和MnFe蛋白具有g≈4。3、3。7和2。0的特征EPR信号, 但各处信号强度比例不同。 在对污染Mo可能引起的信号进行校正后,CrFe蛋白的三个信号强度分别相当于DT还原OP MoFe蛋白的20%, 0%和10%, 而MnFe蛋白则分别相当于112%, 49%和65%。 上述结果表明, CrFe蛋白和MnFe蛋白与OP MoFe蛋白金属原子簇的主要差异很可能在于FeMco (M=Cr, Mn或Mo)的M种类, 而P-cluster结构和组成均未见大的差异。 利用气相扩散悬滴法对MnFe蛋白和CrFe蛋白结晶条件进行了筛选和初步优化, 确定了以Tris/Hepes, NaCl, MgCl2和PEG 8000为主要变量的沉淀剂体系, 寻找各组分对于晶体生长的最适浓度。 以此为基础探讨了应用气相扩散坐滴法和液-液扩散法对两种蛋白结晶条件的优化。 在一定条件下, 两种蛋白分别通过液-液扩散法获得了优质大单晶。 对从CrFe蛋白和MnFe蛋白制备物中培养出的蛋白质晶体的SDS-PAGE鉴定显示, 晶体由与OP MoFe蛋白相似的两种亚基组成。 通过 “神舟三号” 飞船搭载实验探讨了空间微重力对于厌氧蛋白质结晶的影响, 结果表明, 微重力有助于避免孪晶形成, 并具有长期培养后获得适于进行X-射线衍射分析的优质大单晶的潜在前景。 结合空间科学使固氮酶结构与功能研究得以发展, 这项工作是有意义并且可行的。 |
语种 | 中文 |
页码 | 102 |
内容类型 | 学位论文 |
源URL | [http://ir.ibcas.ac.cn/handle/2S10CLM1/14170] |
专题 | 中科院植物分子生理学重点实验室 |
作者单位 | 中国科学院植物研究所 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 赵颖. 含铬或锰的新型固氮酶的纯化, 特性和结晶—棕色固氮菌突变种UW3中CrFe蛋白和MnFe蛋白的研究[D]. 中国科学院植物研究所. 2005. |
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