| 题名 | 乌鳢免疫相关基因的克隆鉴定与特征分析 |
| 作者 | 贾伟章 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2007-06-16 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 授予地点 | 水生生物研究所 |
| 导师 | 徐旭东 ; 郭琼林 |
| 关键词 | 差减cDNA文库 干扰素系统 干扰素调控因子 干扰素刺激基因 信号通路 免疫相关基因 |
| 其他题名 | Molecular cloning, identification and characterization of immune-relevant genes in snakehead Channa argus |
| 中文摘要 | 鱼类具备两种基本的免疫应答类型：先天性免疫应答和适应性免疫应答。头肾主要由网状内皮系统支持下的淋巴造血组织构成，包括淋巴细胞、单核细胞、浆细胞、两种或三种的粒细胞以及巨噬细胞等，担负着机体特异性和非特异性免疫反应，在个体发育过程中可能为免疫系统的生发中心。为了解乌鳢在病原刺激后的免疫反应，以及为鱼类分子免疫学研究提供一定的科学依据，本研究以poly I:C体内诱导乌鳢为测试组，对照鱼为驱动组，通过抑制差减杂交构建富含诱导后差异表达基因的乌鳢头肾差减cDNA文库。利用PCR和斑点杂交筛选文库，揭示了一批与哺乳类IFN系统基因同源，参与干扰素信号转导和转录调控的相关基因，如信号转导和转录激活因子（STAT）、干扰素调控因子（IRF），IFN刺激基因（IFN stimulated gene, ISG）或抗病毒基因，如Viperin、ISG15和ISG12，以及其他的免疫相关基因包括鼠李糖凝集素（RBL）、组织相容性抗原复合物（MHC I）、免疫球蛋白重链和轻链（IgM和IgL）、热休克蛋白70（HSP70），受体激活蛋白C（RACK）等。 通过RACE扩增的方法获得乌鳢STAT1、IRF1、Viperin、ISG15 cDNA全长。在此基础上，根据乌鳢IRF1以及已知IRF2和IRF7同源分子，设计位于开放阅读框保守位置的IRF2和IRF7兼并引物，扩增IRF2和IRF7片段。进而完成了三个干扰素调控因子cDNA和基因组克隆。分析三种鱼类干扰素调控因子的基因结构，并与人类IRF1、IRF2和IRF7基因进行了比较基因组学研究，发现IRF1和IRF2基因在进化上具有高度的保守性，外显子和内含子的组织模式在乌鳢和人基本一致，并且IRF1和IRF2基因之间也存在进化的保守性，尤其DNA结合区的外显子区段；乌鳢IRF7 5′ 端非编码区未出现内含子，这使该基因的组织模式与人IRF7显著不同。同时检测了三种IRF的组织分布，并且证实这些基因在脾脏和肝脏中能够被poly I:C诱导表达。为了解干扰素调控因子表达的分子基础，通过基因步移的方法，获得乌鳢三个干扰素调控因子的启动子序列。分析乌鳢干扰素调控因子启动子区的目的是寻找可能的转录因子结合位点，了解IRFs的表达调控，以及干扰素调控因子能够被病毒和双链RNA诱导表达的分子机理。此外，通过基因步移的方法，我们还获得了STAT1、Viperin和ISG15的启动子序列，鉴定了两种干扰素刺激基因，并比较了这两种干扰素刺激基因的启动子区特征。我们发现在Viperin和ISG15启动子区存在保守的干扰素刺激反应元件（ISRE）和γ-干扰素激活序列（GAS）。此外，Viperin启动子区包含保守的NF-κB结合位点，这是保守的NF-κB结合位点以一致的序列模式（GGGRNNYYCC）出现在鱼类干扰素刺激基因启动子区的首次报道。通过分析乌鳢STAT1和IRF7启动子序列特征，表明鱼类存在类似哺乳动物信号反馈的传导通路调控细胞对干扰素信号的反应。这为研究干扰素系统基因的调控奠定了基础。在此基础上，我们讨论了干扰素调控因子在调控免疫相关基因和病毒或干扰素介导的信号传导通路中潜在的角色。从低等脊椎动物到高等脊椎动物，鱼类和哺乳类干扰素和抗病毒蛋白呈现不同水平的差异，这从一定程度上反映了它们在不同生境中遭遇不同病原的选择压力。然而，根据我们的结果来看，不仅干扰素信号通路成员是保守的，而且干扰素调控因子和干扰素刺激基因的调控方式均与哺乳动物类似。此外，用RACE-PCR扩增的方法克隆到MHC I类分子，免疫球蛋白重链和轻链，RBL等全长cDNA序列。通过基因步移的方法获得RBL基因全长及其启动子序列。检测了STAT1、Viperin、ISG15、MHC I和RBL基因在各组织中的表达情况，同时还检测了poly I:C诱导后Viperin和ISG15在肝脏中的诱导表达。 在差减杂交和同源PCR的基础上，通过RACE和基因步移，我们克隆并鉴定了STAT1、IRF1、IRF2、IRF7、Viperin、ISG15，以及其他免疫相关基因。着重对干扰素系统几个基因的结构特征、表达特性、诱导机制、分子进化等进行了比较研究，初步揭示出鱼类存在复杂的调控网络介导IFN系统基因的表达。乌鳢免疫相关基因的研究工作对了解鱼类免疫机制以及鱼类抗病药物的开发具有重要的理论指导意义。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-11-16 |
| 页码 | 190 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12276]  |
| 专题 | 水生生物研究所_中科院水生所知识产出（2009年前）_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 贾伟章. 乌鳢免疫相关基因的克隆鉴定与特征分析[D]. 水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所. 2007. |
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