| 题名 | TALEN和CRISPR/Cas9 技术介导的靶向基因破坏和同源修复 |
| 作者 | 胡政 |
| 答辩日期 | 2014-04-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 陈永龙 |
| 关键词 | TALEN CRISPR Cas9 靶向基因破坏 同源修复 |
| 学位名称 | 理学博士 |
| 其他题名 | Targeted Gene Disruption and Homology-Directed Gene Repair Mediated by TALEN and CRISPR/Cas9 System |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 英文摘要 | 基因组定向修饰对基础研究及转化医学研究都极为重要。TALEN和CRISPR/Cas9是两种新近研发出的人工核酸酶，可以对基因组特定位点进行准确地切割，从而激活细胞内的两种DNA修复机制，一是通过非同源末端连接的方式造成插入或缺失突变；二是在提供外源同源序列模板的情况下，可极大地促进基于同源重组的基因定点修饰。以猪及爪蛙等为动物模型的基因敲除研究因为缺少类似小鼠胚胎干细胞打靶的方法而受到极大限制；目前对特定基因突变位点进行修复的方法效率低下。为解决这些难题，我们利用TALEN和CRISPR/Cas9 技术进行了以下三方面的研究。 第一，设计并组装猪胰腺转录因子Pdx1特异的TALEN 质粒，通过电击转染入猪胎儿成纤维细胞，获得基因打靶的阳性克隆后，通过体细胞核移植技术成功获得Pdx1基因敲除猪，因此，在大动物中实现了高效基因敲除。第二，将体外转录的Cas9 mRNA和gRNA一起共注射入热带爪蛙受精卵后发现RNA引导的Cas9核酸酶可以准确、高效地造成目的基因破坏，不仅实现了当代基因表型分析，而且通过高效种系传递建立了热带爪蛙基因敲除品系，为热带爪蛙基因敲除建立了一种更简便、高效的方法。第三，我们将Cas9编码框、gRNA表达框及GFP编码框共同组装在一个质粒上，利用单链DNA（ssODN）模板结合连接酶IV抑制剂SCR7,在MCF-7和HCT-116细胞中分别对 AAVS1位点和β-catenin缺失突变（ΔTCT Ser45）位点实现了高效同源修复。我们的研究有助于推进基因点突变修复的疾病模型研究及临床应用。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 页码 | 122 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1034]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 胡政. TALEN和CRISPR/Cas9 技术介导的靶向基因破坏和同源修复[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2014. |
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