| 题名 | 基于等温链置换扩增的缺失型α-地中海贫血检测方法研究 |
| 作者 | 余路新 |
| 答辩日期 | 2013-10-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 曾令文 |
| 关键词 | 地中海贫血 核酸等温链置换扩增 试纸条生物传感器 微孔板核酸杂交法 |
| 学位名称 | 理学博士 |
| 其他题名 | DNA assay based on isothermal circular-strand displacement polymerization reaction for the detection of deletional α-thalassemia |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 英文摘要 | 地中海贫血是一种常见的慢性溶血性血液疾病，呈常染色体隐性遗传规律。我国南方是该病的高发区，α-地中海贫血和β-地中海贫血在广东省人群的基因携带率分别为：8.53%和2.54%。α-地中海贫血以缺失型为主，其三种主要的缺失型（东南亚缺失型（--SEA）、右侧缺失（-α3.7）和左侧缺失（-α4.2））占所有α-地中海贫血所有突变的96.03%，其中东南亚缺失型又占所有α-地中海贫血所有突变47.49%。本病尚无有效的治疗方法，开展婚前检查、产前诊断，防止新生儿患儿的出生，是预防本病最有效的方法。现在阶段，临床上α-地中海贫血的基因检测主要通过PCR依赖的方法检测三种常见的缺失型。而传统的方法往往需要昂贵的仪器，操作复杂，费时费力，需要专门的技术人才，难以满足现场快速检测的需要。近年来，试纸条生物传感器因其操作简单、成本低廉、分析时间短等优点而备受关注。检测结果肉眼可见，与便携式扫描仪配合使用还能进行半定量检测。微孔板杂交法是将PCR技术，核酸杂交技术和酶联免疫技术有机结合起来一种简便、快速、客观、灵敏和特异的检测方法。核酸等温链置换扩增是一种在等温条件下高效扩增的新技术。本论文以试纸条生物传感器和核酸杂交法为检测平台，以核酸等温链置换扩增为信号放大的手段，建立了两种α-地中海贫血东南亚缺失型的基因检测方法。主要内容分以下两部分： （1）基于核酸等温链置换扩增和试纸条生物传感器的α-地中海贫血东南亚缺失型的基因检测。 发夹结构的核酸探针的5’端带有生物素标签，加入被检测的目标核酸后，因其与发夹结构的核酸探针中的环状部分完全互补，从而使发夹结构的核酸探针的茎环结构打开；引物与打开的核酸探针退火在聚合酶作用下进行聚合延伸与链置换作用，把被检测的核酸置换下来，被置换下来的核酸又可以打开剩余的发夹结构的核酸探针，开展新一轮的循环，最终产生大量的一端带有地高辛标签，另一端带有生物素标签的双链DNA产物。利用胶体金试纸条检测平台对该双链产物检测，最低检测限为0.01 fM，并在低浓度1 fM至1 pM间呈良好的线性。同时检测了86份临床样本基因组DNA，以传统的gap-PCR为对比，其符合率达100%。该方法更加简便快捷，结果肉眼可见，不需要特殊仪器，可以满足现场筛查的检测需求。 （2）基于核酸等温链置换扩增和微孔板核酸杂交法的α-地中海贫血东南亚缺失型的基因检测。 在96孔微孔板上包被发夹结构的核酸探针，加入目标核酸后与包被的发夹结构核酸的环部分完全互补配对，从而打开发夹结构，在引物和聚合酶作用下，通过引物合成新链能把目标核酸置换下来，被置换下来的核酸又可以打开剩余的发夹结构的核酸探针，开展新一轮的循环，最终生成大量带有生物素标记双链核酸产物。与亲和素-辣根过氧化物酶结合后，可催化底物四甲基联苯氨显色，通过酶标仪定量检测。该方法最低检测限为8 aM，线性范围为0.1 fM 至10 nM。整个分析可以在两小时内完成，且特异性良好。该方法最大的优点是可以实现高通量检测，特别适合于大规模的人群筛查。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 页码 | 81 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1013]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 余路新. 基于等温链置换扩增的缺失型α-地中海贫血检测方法研究[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2013. |
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