| 题名 | 大鼠P2X2离子通道跨膜区氨基酸残基相互作用的研究 |
| 作者 | 梁欣 |
| 答辩日期 | 2013-09-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 李志远 |
| 关键词 | P2X受体 亚基相互作用 离子通道 膜片钳 |
| 学位名称 | 博士 |
| 其他题名 | Study of Amino Acidic Residues Interaction on Two Transmembrane Domains of Rat P2X2 Receptor |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 英文摘要 | P2X受体（P2X receptor）是ATP激活的非选择性阳离子通道，在人体各类细胞上均有表达。因此P2X受体介导人体多种生理和病理过程，从神经突触传导到味觉和骨质形成、疼痛信号传导到免疫系统。现已公认，P2X受体是开发镇痛、消炎等药物的有效靶点。 2009年斑马鱼P2X4受体（zfP2X4 receptor）晶体结构的出现，证明了P2X受体是通过亚基-亚基间相互作用组成的圣杯型三聚体离子通道。这也进一步证实了多年来大量基于突变实验的猜测及P2X受体的功能数据。虽然ATP激活状态下的晶体结构展现了受体跨膜区存在相互作用，但是在开放状态和关闭状态下，跨膜区1和跨膜区2的哪些氨基酸具有相互作用？存在于斑马鱼P2X4受体跨膜区间的相互作用是否存在于其他种属其他亚型受体中？它们是如何稳定和影响孔道的开放关闭过程的？这些问题仍然不清楚。本论文采用半胱氨酸突变法结合膜片钳技术和rP2X2同源模型发现并研究跨膜区相互临近的氨基酸残基，并进一步探究这些氨基酸残基是如何影响rP2X2受体从关闭状态到开放状态的转变过程。实验通过检测细胞在二硫苏糖醇孵育前后的ATP电流改变来研究通道功能的改变。主要研究结果总结如下：⑴ 发现三十五对半胱氨酸双突变体都具有正常的通道功能，但是没有一个突变体可以形成二硫键，实验结果表明关闭状态下的rP2X2受体中不存在亚基-亚基间氨基酸相互作用。⑵ H33C/S345C经二硫苏糖醇还原后导致电流增加2至3倍，表明H33C和S345C在空间距离上足够近可以形成二硫键。Western blot以及双突变循环分析进一步证明His33和Ser345的相互作用存在于亚基内部。 ⑶ H33C/S345C和V48C/I328C在二硫苏糖醇孵育前EC50分别比孵育后高出~2倍和~4倍，二硫苏糖醇还原使得两个突变体的EC50降至野生型水平。结果表明H33C和S345C在空间距离上足够近可以形成二硫键，同时也为证明在P2X通道开放过程中亚基-亚基间相互作用比亚基内部相互作用具有更重要的作用提供了依据。⑷ Cd2+金属架桥形成实验表明，两个S345C和一个His33可以与Cd+形成较为稳定的、偏离孔道中心轴的金属架桥，证明Ser345和His33在开放状态下孔道的狭窄区域内距离足够近（约为4.5 ?）。 ⑸ 阳离子通透实验初步表明，跨膜区1上的Tyr43通过协同跨膜区2上的Ser340部分脱去水合阳离子的水分子控制离子进出孔道，从而调控Ca2+电流。 综上所述，大鼠P2X2受体跨膜区氨基酸残基相互作用的研究提供了孔道分子空间结构的新数据，为进一步研究P2X受体孔道开放机制提供了新的思路，也为以P2X受体为靶标的药物开发提供新的理论依据。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 页码 | 114 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1010]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 梁欣. 大鼠P2X2离子通道跨膜区氨基酸残基相互作用的研究[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2013. |
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