| 题名 | 葡萄糖激酶、elaiophylin糖基转移酶和富亮氨酸重复激酶2的结构功能研究 |
| 作者 | 刘强 |
| 答辩日期 | 2011-11-14 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 刘劲松 |
| 关键词 | 葡萄糖激酶 elaiophylin糖基转移酶 富亮氨酸重复激酶2 晶体结构 催化机制 |
| 学位名称 | 博士 |
| 其他题名 | Structural and functional studies of glucokinase, elaiophylin glycosyltransferasesa and Leucine-rich Repeat Kinase 2 |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 英文摘要 | 第一章 哺乳动物糖酵解的第一步由己糖激酶催化。己糖激酶Ⅳ即葡萄糖激酶(GK)大小约为50 kDa,其主要功能是将葡萄糖和其他六碳糖磷酸化。GK主要存在于肝脏、胰岛组织、神经元、垂体、肠道内分泌K和L细胞中。GK在葡萄糖动态平衡中的有着重要作用。它能严密的调控葡萄糖代谢，其对葡糖糖调控的有着和胰岛素及胰高血糖素一样的重要性。GK基因的突变对其在细胞中的功能有着很大的影响。GK缺陷被认为与糖尿病有着重要的联系。E339K突变最近被发现与高血糖症有关。与野生型蛋白相比该突变的酶活性降低和蛋白稳定性下降。我们表达、纯化、结晶并解析了该突变体蛋白与葡萄糖的复合结构。结构显示E339K突变导致His416侧链构象发生变化，从而占据了部分ATP结合位点。另外ATP结合位点的Ser411发生磷酸后与Thr82形成氢键阻碍了ATP结合。这些发现阐释了突变导致酶活变化的结构基础，同时也让我们更好理解GK机制及E339K突变怎样导致高血糖。 第二章 糖基转移酶(GT)是一种普遍存在的酶，其作用是催化糖供体与各种糖基受体之间的糖苷键的形成。糖基转移酶是一个大家族，涉及到合成许多生物活性产物诸如单糖、多糖、复合糖等。聚酮化合物elaiophylin(Ela)具有很广谱的抗菌和抗真菌活性，此前曾报道可从从多种放线菌中分离得到。目前中科院南海海洋研究所张长生研究员实验室从南中国海海底沉淀物中的Streptomyces sp. SCSIO 01934菌株中也发现了elaiophylin。而根据预测ElaGT负责添加Ela两端的脱氧糖基。此前在竹桃霉素和除虫菌素中曾发现类似的反复添加两端糖基的GT。但是这类GT的酶催化机制尚未阐明。因此通过分析ElaGT的结构并阐述ElaGT底物专一性和催化机制极其重要，所以本研究将着重于研究ElaGT的结构以期能对该类GT的催化机制有深入的了解并为后续研究打下基础。我们共获得ElaGT三种形式的晶体：apo-form, UDP-binding form 和 elaiophylin-binding form。晶体结构显示ElaGT属于GT-B构象。其主要由两个大的结构域构成,每个结构域都含有一个βαβ Rossmann结构,两个结构域隔得很开并面对面地对着，中间形成的一个沟为活性位点。底物结合时ElaGT会有构象变化。这些发现有助于解释ElaGT识别UDP和elaiophylin的机制，并加深了解放线菌生物催化合成抗生素的原理。 第三章 帕金森病是一种常见的进行性发展的中枢性神经系统神经退行性疾病。在最近这些年里，发现lrrk2基因的突变体与PD的发生有着密切的联系。LRRK2是一个多结构域的蛋白质，具有GTPase 和丝氨酸/苏氨酸激酶的活性。在功能上，LRRK2蛋白影响着神经元的生长，细胞增值和信号转导等多种过程。而与疾病发生最密切相关的则是G2019S这个突变体，该突变增强了激酶的活性，这与细胞凋亡相关。但是仍有许多的问题有待于解释， LRRK2蛋白的结构和功能研究能够帮助我们更好的了解PD发病机制。晶体学研究中需要稳定、可溶的蛋白。为了获得可溶蛋白，我们首先通过生物信息学方法对LRRK2的结构域进行预测，然后截取不同片段构建不同的克隆。我们同时尝试了用大肠杆菌和昆虫细胞进行表达筛选。在大肠杆菌表达系统中我们还通过改变表达载体、表达条件和表达菌株等方法改善蛋白的溶解性。在经过手工的大规模筛选之后我们获得了几个可溶片段，并对这几个片段进行了初步纯化。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 页码 | 126 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/975]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 刘强. 葡萄糖激酶、elaiophylin糖基转移酶和富亮氨酸重复激酶2的结构功能研究[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2011. |
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