题名 | Wnt信号通路辅助受体LRP5在卵巢癌中的作用及分子机制 |
作者 | 马玉玲 |
答辩日期 | 2014-05 |
文献子类 | 硕士 |
授予单位 | 中国科学院大学 |
导师 | 唐亚雄 |
关键词 | 人卵巢癌 Dn-lrp5 Wnt Emt 裸鼠 |
学位专业 | 药物化学 |
英文摘要 | 实验目的 卵巢癌是女性生殖系统常见的三大癌症之一,病死率居妇科癌症首位。其早期症状隐匿、易发生多脏器移植、淋巴结转移,确诊时70%已属晚期,5年生存率低。卵巢癌的侵袭及转移是造成其治疗困难、病死率高的主要原因。原癌基因Wnt信号通路在胚胎发育、干细胞、免疫系统以及肿瘤发生等生理病理过程中发挥重要作用。作为Wnt信号通路的辅助受体,低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low density lipoprotein receptor related – protein 5 LRP5)与肿瘤的浸润转移密切相关。本文主要研究了LRP5的显性负突变体DN-LRP5(dominant-negative LRP5)对人卵巢癌HO8910PM(高转移)细胞的生长、迁移的作用,并对其分子机制进行初步的探索。 实验方法 1. 通过亚克隆构建pLVX-IRES-zsGreen1-DN-LRP5及pLVX-puro-DN-LRP5慢病毒表达载体,在嘌呤霉素筛选后获得能够稳定表达DN-LRP5的HO8910PM细胞株。 2. 增殖抑制分析:通过MTT实验考察DN-LRP5对HO8910PM细胞生长的影响。 3. 细胞迁移的检测:通过Transwell assay及Scratch assay检测DN-LRP5对HO8910PM细胞迁移的影响 4. 免疫荧光染色:FITC-鬼笔环肽细胞免疫荧光染色观察细胞骨架重构引起的细胞形态的变化。 5. EMT相关蛋白的检测:通过Western blot确定DN-LRP5对HO8910PM细胞上皮标志蛋白、间质标志蛋白及相关转录因子表达的影响;通过明胶酶谱确定DN-LRP5对MMP2/9酶活性的影响。 6. 裸鼠体内实验:通过皮下及尾静脉接种HO8910PM/pLVX及HO8910PM/DN-LRP5细胞,检测肿瘤的生长及转移情况。 实验结果 1. 成功构建慢病毒表达载体pLVX-IRES-zsGreen1-DN-LRP5及pLVX-puro-DN-LRP5并建立HO8910PM稳定细胞系 2. 增殖抑制分析:与HO8910PM/pLVX对比,HO8910PM/DN-LRP5在细胞铺板后的第3天,5天的生长速率显著降低。 3. 细胞迁移的检测:通过Transwell assay及Scratch assay可以看出DN-LRP5能够明显的抑制HO8910PM细胞的迁移。 4. 免疫荧光染色:细胞铺板16h后,FITC-鬼笔环肽及DAPI染色显示,空载体对照组HO8910PM/pLVX胞体周围伸出伪足,而HO8910PM/DN-LRP5并没有明显的伪足出现。 5. EMT相关蛋白的检测:通过Western blot 检测,发现DN-LRP5能够引起HO8910PM细胞中EMT相关蛋白的表达发生变化。与HO8910PM/pLVX对比,HO8910PM/DN-LRP5中上皮标志蛋白E-cadherin、Keratin 8/18的表达量明显上调,间质标志蛋白Vimentin、Fibronectin的表达明显下调,相关转录因子Slug、Twist也略有下调。同时也发现HO8910PM细胞导入DN-LRP5后,p-GSK3β,p-MAPK,等表达明显下调。 6. 裸鼠体内实验:裸鼠皮下接种HO8910PM/pLVX及HO8910PM/DN-LRP5细胞,发现接种HO8910PM/DN-LRP5的肿瘤瘤块体积明显小于HO8910PM/pLVX。 结论 成功构建了慢病毒表达载体pLVX-IRES-zsGreen1-DN-LRP5及pLVX-puro-DN-LRP5,通过嘌呤霉素筛选获得了稳定细胞系,并初步探讨了DN-LRP5对HO8910PM细胞生长及迁移的影响及其分子机制。DN-LRP5能够显著抑制HO8910PM细胞的生长,同时引起上皮标志蛋白上调,间质标志蛋白以及转录因子的下调,使得细胞的迁移能力明显下降,并通过裸鼠体内实验进一步得到证实。另外,LRP5与其他信号通路包括GSK-3β、IGF、JNK等协同发挥其对卵巢癌的作用 |
语种 | 中文 |
学科主题 | 天然产物研究 |
产权排序 | 1 |
内容类型 | 学位论文 |
源URL | [http://210.75.237.14/handle/351003/28832] |
专题 | 成都生物研究所_天然产物研究 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 马玉玲. Wnt信号通路辅助受体LRP5在卵巢癌中的作用及分子机制[D]. 中国科学院大学. 2014. |
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