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题名	基于重组酶的等温解开双链DNA方法的建立及应用
作者	陈刚毅
答辩日期	2016-10
文献子类	博士
授予单位	中国科学院大学
导师	唐卓
关键词	重组酶 双链dna 等温
学位专业	药物化学
英文摘要	核酸是生命体至关重要的物质。脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的载体，它编码细胞内所有结构蛋白质和功能蛋白质的氨基酸序列。DNA扩增在基础研究、临床诊断、法医学、传染病学以及古生物学等领域都是非常重要的工具。目前应用最广泛的聚合酶链式反应(PCR)虽然反应简单、灵敏度高，但对PCR仪依赖性强，而且对操作人员专业技术要求高，因此很难实现现场分析检测。于是，科学家们又发展了很多等温扩增方法来替代PCR。等温扩增能在等温条件下特异性的完成DNA扩增，对仪器的门槛要求低，反应时间短，更能满足快速检测的需求；然而目前大多数等温扩增只能以单链作为模板，如果需要扩增双链DNA，必须在反应前增加一步加热变性的步骤。重组酶是一类广泛存在于生物体内的重要蛋白，在体内的主要作用是与体内短暂出现的单链DNA形成形成复合物，此复合物会扫描双链DNA，当发现与复合物中单链DNA同源序列时复合物能在这个位置解开双链DNA使单链DNA与其中一条互补链形成配对。这种等温条件下解开双链DNA的特性为重组酶应用于等温扩增反应提供了思路。本论文主要利用重组酶建立了一个通用的解开双链DNA的方法，然后对该方法进行了系统的优化，并将其应用到了解旋酶依赖的等温扩增反应中。本文主要包括四个部分：第一部分主要对等温扩增反应、同源重组以及重组酶系统进行了较为系统的综述。第二部分利用重组酶建立了一个通用的解开双链DNA的方法。首先，在只有RecA参与的情况下，我们设计实验建立了单链DNA探针与同源双链DNA的链交换与延伸的方法，这为大部分的等温扩增方法提供了第一步解开双链进行延伸的手段，从而使它们可以检测双链，进一步研究发现在单链DNA结合蛋白(SSB)存在的情况下加入反向引物可以将模板扩增大约240倍，这对其它的等温检测方法增加检测的灵敏度有很大帮助。然后，建立了两条单链DNA探针在RecA的辅助下以双链DNA为模板进行的连接反应。由于一些等温检测方法建立在连接反应的基础上，而普通的连接反应只能以单链作为连接的模板，如果要以双链为模板只能通过加热变性，因此我们建立的方法为这些等温检测方法提供了强有力的手段。第三部分我们对基于缺口酶的链置换等温扩增反应进行了系统的优化并将第二部分建立的等温解开双链DNA方法应用其中。我们发现单链结合蛋白的加入使基于缺口酶的链置换等温扩增反应的特异性大大增加。另外，我们初步尝试将基于重组酶的解开双链DNA方法用于为基于缺口酶的链置换等温扩增反应提供模板，最终实现一步等温的链置换扩增反应。但目前的检测灵敏度还不够高而体系又比较复杂，因此目前我们正在做进一步的优化。第四部分我们将建立的等温解开双链DNA方法应用于解旋酶依赖的等温扩增反应中。我们发现先用基于重组酶的等温解开双链DNA方法对质粒模板进行一定程度的扩增，再将得到的平末端双链DNA产物作为解旋酶依赖的等温扩增反应的模板可以大大提高扩增效率。将质粒混合到等温解开双链DNA体系中后直接作为模板加入解旋酶依赖的等温扩增反应中还能实现37℃温度条件下一步等温扩增反应。
语种	中文
学科主题	天然产物研究
产权排序	1
内容类型	学位论文
源URL	[http://210.75.237.14/handle/351003/28809]
专题	成都生物研究所_天然产物研究
推荐引用方式 GB/T 7714	陈刚毅. 基于重组酶的等温解开双链DNA方法的建立及应用[D]. 中国科学院大学. 2016.

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