| 题名 | 低温胁迫下蒺藜苜蓿转录组及MtJMJC5基因的可变剪接特性和初步功能分析 |
| 作者 | 沈迎芳 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2016 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 刘登才 ; 王海庆 |
| 关键词 | 蒺藜苜蓿 低温胁迫 转录组 组蛋白去甲基化酶 MtJMJC5 可变剪接 |
| 中文摘要 | 低温是影响植物生长、发育和地理分布的一个重要非生物胁迫因子之一。紫花苜蓿（Medicago sativa）是优异豆科牧草，遗传背景复杂，在严寒的北方和高海拔地区易发生冻害。提高苜蓿抗寒性是目前高寒地区重要的育种目标。紫花苜蓿抗寒性改良关键在于抗性遗传资源的获得、有效利用和对其低温胁迫响应机制信息的了解。豆科模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）遗传背景简单，与苜蓿亲缘关系近，基因组间同源性高，便于遗传分析。借鉴蒺藜苜蓿研究对促进包括紫花苜蓿在内的豆科牧草的抗寒性改良应用具有重要参考价值。转录组测序分析技术可为牧草抗逆新基因资源发掘及种质资源创新提供新的研究思路。表观遗传修饰在植物逆境胁迫响应中发挥重要作用。组蛋白甲基化是真核细胞中基因表达调控的一种重要的表观修饰机制，含有 Jumonji C 结构域的组蛋白去甲基化酶参与移除组蛋白赖氨酸或精氨酸残基上的甲基基团。拟南芥中 JMJ30/JMJD5是含 Jumonji C 结构域的家族成员，为植物生物钟调控系统的组件。尽管有一些植物生物钟基因在应答外界环境信号时存在可变剪接现象，但还没有报道显示JMJ30/JMJD5 具有环境信号调控的可变剪接。本文通过 Illumina 测序技术分别对低温处理 0 h，8 h，24 h 和 3 d 的蒺藜苜蓿幼苗进行了转录组测序及生物信息学相关分析。根据 RNA-seq 测序结果，筛选出一个与JMJ30/JMJD5 高度同源的生物钟相关基因，对其表达特性和初步功能进行了进一步分析。 主要研究结果如下： （1）采用 RNA-seq 技术，通过序列比对及数据分析，共得到 111.38 M 条reads，总碱基数为 22.49 G。从中获得 5799 个低温应答基因，其中上调的基因数为 2403 个，下调的基因数为 2388 个。将提取的新基因序列与各数据库进行比对，最终得到有功能注释的新基因共 776 个。 （2）对筛选的目的基因进行系统进化分析，结果显示 MtJMJC5 基因编码的氨基酸序列与拟南芥 JMJ30/JMJD5 蛋白高度同源，而 JMJ30/JMJD5 为保守的生物钟组件。氨基酸序列比对显示，MtJMJC5 编码一个 JmjC domain-only 蛋白，存在 α-ketoglutarate 和 Fe(ii)-结合残基。利用半定量 RT-PCR 分析了蒺藜苜蓿MtJMJC5 基因在低温长日照、长日照和连续光照、各非生物胁迫及 ABA 处理下的表达特性，结果显示 MtJMJC5 存在依赖于低温的可变剪接现象。生物节律和低温胁迫信号可能对其转录调节存在互作效应。 （3）对低温胁迫下 MtJMJC5 转录本 RT-PCR 产物克隆及测序显示，MtJMJC5基因存在 4 种主要的 RNA 剪接异构体，除 MtJMJC5α 编码具有完整氨基酸序列的蛋白产物外，其余三种可变剪切体（MtJMJC5β、MtJMJC5γ 和 MtJMJC5δ）由于第 1 或第 2 内含子的 3′ 可变剪切而存在提前终止密码子（prematuration termination condon）。根据测序结果设计相应的特异引物，用菌落 PCR 分析四种可变剪接异构体所占的比例，发现 MtJMJC5α 和 MtJMJC5β 为主要的可变剪接体类型。用 qRT-PCR 定量检测低温胁迫下 4 类不同的 MtJMJC5 可变剪接体的丰度，可变剪接体MtJMJC5β和MtJMJC5δ的丰度存在上调，而MtJMJC5α和MtJMJC5β则为下调。同时进一步证实 MtJMJC5 依赖于低温的可变剪接具有可逆性。 （4）将蒺藜苜蓿幼苗用放线菌酮处理，用 qRT-PCR 分析含提前终止密码子的 MtJMJC5 可变剪接异构体命运，发现 3 类含提前终止密码子的剪接异构体受无义介导的降解途径（nonsense-mediated decay）调控。 （5）构建了植物表达载体 pBI-MtJMJC5-EGFP，转化拟南芥，研究 MtJMJC5在拟南芥中超表达对植株的生长发育及表型相关基因的表达情况。荧光显微镜下亚细胞定位观察，发现 MtJMJC5 主要定位于细胞核中。过表达 MtJMJC5 的拟南芥呈现早花表型，莲座叶叶片数存在明显差异。对拟南芥中与花期相关的基因表达的 qRT-PCR 检测显示，过表达 MtJMJC5 的植株花期抑制因子 FLC 的表达下降，而开花整合子 FT 表达上调，表明 MtJMJC5 参与了植株的开花途径。 总之，转录组研究揭示了低温胁迫下蒺藜苜蓿转录组的整体表达特征，为豆科植物耐寒机制研究提供了重要的参考信息。对 MtJMJC5 基因的表达特性和初步功能分析表明，含 JmjC 结构域的组蛋白去甲基化酶基因 MtJMJC5 能在植物非生物胁迫反应中发挥作用。从表观遗传学层面和可变剪接角度为解释植物适应外界低温环境的分子机制提供了新的信息和线索，同时也为苜蓿抗寒性改良应用提供了参考。 |
| 语种 | 中文 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.nwipb.ac.cn/handle/363003/5901]  |
| 专题 | 西北高原生物研究所_中国科学院西北高原生物研究所 |
| 作者单位 | 中国科学院西北高原生物研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 沈迎芳. 低温胁迫下蒺藜苜蓿转录组及MtJMJC5基因的可变剪接特性和初步功能分析[D]. 北京. 中国科学院大学. 2016. |
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