| 题名 | 超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究; Study on Gigaporous Chromatographic Process of Virus-like Particles Purification |
| 作者 | 于孟冉 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2015-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 苏志国 |
| 关键词 | 类病毒颗粒 超大孔色谱填料 乙肝表面抗原 填料孔径 结构稳定性 等温滴定量热法 |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 中文摘要 | 类病毒颗粒（Virus-like particles, VLPs）是一类用于传染性疾病预防的重要新型疫苗，有效的分离纯化是确保其安全性和有效性的关键。色谱分离是生物大分子分离纯化最主要的技术，商品化的色谱填料主要是为常规蛋白质设计，孔道一般小于30 nm，而VLPs通常由上百个亚基组装而成，尺寸在20~100 nm，因此其在传统填料中的扩散速率慢，甚至会堵塞孔道，导致分离时间过长，以及产物在操作中大量失活。为此，本论文研究孔径达到100 nm以上的新型超大孔色谱填料在乙肝表面抗原类病毒颗粒（Hepatitis B virus surface antigenVLPs，HB-VLPs）分离纯化中的应用，通过与其他类型色谱填料对比，对超大孔填料色谱分离VLPs的过程特点进行了如下系统的研究： （1）选取具有不用孔径的两种琼脂糖填料（DEAE-FF、DEAE-Capto），四种超大孔填料（DEAE-AP-120nm、DEAE-AP-280nm、POROS D和POROS HQ），以及一种整体柱类型的阴离子交换色谱填料，首先考察了孔径对不同尺寸的蛋白质动态载量的影响，发现小孔径的琼脂糖填料对较小尺寸蛋白的结合具有优势，而超大孔填料更适合于HB-VLPs超大分子的吸附，并且有助于获得更高的HB-VLPs抗原活性回收率。 （2）采用单孔和双孔分布模型，对琼脂糖填料和超大孔填料的孔结构进行准确表征。然后深入分析填料孔径对不同大小生物分子静态、动态吸附载量和吸附动力学的影响规律。结果表明，对于水力学半径小于5.4 nm的蛋白，填料的可及比表面积是影响吸附载量的主要因素；而对于水力学半径大于5.4 nm的蛋白，其吸附主要受到填料孔径的影响，大孔填料可以提供更大的可及比表面积和更快的传质速率。 （3）结合激光共聚焦检测、高效液相尺寸排阻色谱分析、以及投射电镜等方法，对HB-VLPs色谱分离过程中，填料孔径对VLPs结构和活性影响的机理进行了分析。VLPs在琼脂糖填料DEAE-FF和DEAE-Capto上的吸附仅限于外表面一薄层区域，而在超大孔填料DEAE-AP-120nm和DEAE-AP-280nm上则可以通过有效的扩散传质进入到孔内部空间，使HB-VLPs在DEAE-AP-280nm上静态吸附载量增加12.9倍，扩散速度提高11.4倍。尤其是超大孔结构还可以有效降低HB-VLPs与填料表面配基之间的多位点结合，避免亚基的解聚，使其结构稳定性得到了大幅度的提高。在2.0 mg/mL-media的进料量的情况下，大约85.5%的HB-VLPs经过DEAE-AP-280nm色谱之后是正确组装的结构，相反的是DEAE-FF由于不可逆的解聚VLPs，有85.2%的VLPs失去正常组装结构。在HB-VLPs实际纯化中，在2.98 mg protein/mL-media进料量，240 cm/h高流速下，经过DEAE-AP-280nm纯化后的抗原活性收率达到68.33%，纯化倍数高达3.47倍。 （4）建立了HB-VLPs在离子交换填料上吸附和发生亚基解聚的热力学模型，从热力学角度阐释填料孔径和配基密度对HB-VLPs吸附过程中结构稳定性的影响机理。微量热滴定技术与色谱实验结果相结合，得到HB-VLPs吸附和解聚过程相关的热力学参数。结果表明，完整的HB-VLPs在填料上吸附的本征摩尔吸附焓均为正值，表面吸附是熵驱动的吸热过程。而吸附过程中伴随亚基解聚产生的摩尔变构焓则均为负数，表明HB-VLPs解聚体的形成是一个焓驱动的自发过程。而且随着填料孔径的减小、或是配基密度的增加，构象变化焓越来越负，表明HB-VLPs亚基的解聚越易于发生。这一结果与色谱实验发现的HB-VLPs完整颗粒吸附过程中，随孔径减小或是配基密度的增加而解聚越严重的结果一致。 本文研究超大孔色谱填料分离纯化HB-VLPs的过程，对于建立高效的VLPs分离纯化工艺具有重要的指导意义。超大孔色谱填料应用于VLPs分离纯化，已经被证实不仅具有高载量、高传质速率的优势，而且从热力学方面可以提高VLPs在液固界面上的结构稳定性，从而保持高的生物活性，因此具有广泛的应用前景。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2016-05-03 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/20309]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 于孟冉. 超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究, Study on Gigaporous Chromatographic Process of Virus-like Particles Purification[D]. 中国科学院研究生院. 2015. |
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